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饿的神啊

新虫 (著名写手)

[求助] 全长P不出来怎么办,求指导 已有4人参与

求哪位大侠给设计一对引物来扩增全长(3512bp),我已经做了2对引物了,都做了温度梯度,然而都没有任何条带
ACACGTACGTTGTGAGTTGTGACCACTACTTTCCCACAAAGAATTTTTTTTTTTTTTCCTAAAAATAAAAAAGATCTCATTTCTATAAGTTGTTTTAGTTTGATTTTACTTGCAGAAGAAAATTGAAGACATGGGAACTGAGGATCATCACCACCAGCATCATCATTCGGACACAGAGGTTCTTGGCAACGAGAGGATCCCGTACAGTGGTCCGCTAAGCGGCCCTTTGAACAAGAGAGTTGGCAGGAAGAGCACCAAGTTTAATTTGGCGACGGAATCAAGCTCAGGCTCGTCACCTCACGATGAGCCTTACGTTGAGATCACACTCGACGTCCGTGACGACTCGGTGGCTGTTCACAGCGTTAAGGCCGCTGGTGGGGATCATAGTAATCTTCAGGAAGATCCTGAGATTACTTTACTTGCAAAAGGGTTAGAGAAAAGGTCAACTTCTTTTGGTTCCAGTGTTGCTAGAACGGCTTCCGCGAAAATCAGGCAGGTGTCTCAAGAGCTCAAGCGCTTGGCTTCCTTTGCGAAGAAGCCTCAGCCGCCTGCCCGGTTTGATAGGAACAAGTCTGCTGCAGCTTATGCTTTGAAGGGGCTCAAGTTCATTAGCAAGACTGATGGTGGTGCTGGTTGGGCTAATGTTGAGAAGCGATTTGATGAAATAACCGCATCTACTAATGGGGTCTTGCCTCGAGCTCGCTTTGGCGAATGCATAGGAATGAACAAGGACTCGAAGGATTTCGCTGTTGAGTTGTTTGATGCTCTTACTCGGAGACGTAATATTCAAGGGGATACAATCACTAAGGATCAGCTAAGAGAGTTTTGGGATCAGATCTCTGATCAGAGTTTTGATTCCAGGCTTCAAACTTTCTTTGACATGGTTGATAAAGATGCAGATGGCAGAATCACGGAAGATGAAGTCAGAGAGATTATCACTCTCAGTGCTTCAGCAAACAAGCTCTCAAATATCCAGAAGCAAGCAGAGGAATATGCAGCTCTTATTATGGAAGAATTGGATCCTGACCATCTCGGATACATCATGATAGACAACCTGGAAATGCTTCTGTTACAAGCACCGGCGCAATCTGTTAAAGGTGGTGAGAGTCGAAACTTGAGCCACATGTTGAGCCAGAAGCTGAAGCCTACACAATTTGACAACCCAATTAGGAGATGCTGCGACAGCACCATGTACTTTTTACTGGACAATTGGCAAAGGGTGTGGGTGATGGCACAGTGGATTGGAGTGATGGCAGGGCTATTTACATACAAATACATTCAGTATAAAAACAGAGCTGCATTTGAAGTAATGGGACACTGCGTGTGCATGGCCAAAGGTGCTGCTGAGACGCTAAAATTCAACATGGCTCTGATTTTATTACCCGTCTGTCGAAACACCATTACATGGCTCAGAAACAAGACCAAACTCAGTGGTGTTGTTCCATTTGATGACAACCTCAATTTCCACAAGGTGATAGCAGTTGGAATCTCAATTGGGGTCGGAATACATGCTATTTCACATTTAGCATGCGATTTCCCTCGGCTTATAAATGCAAGTGAAGAGAAGTATGAGCCAATGGAGCCATATTTTGGGGATCAGCCCAAAAATTACTGGCATTTTGTGAAGTCAGTAGAAGGGGTAACTGGGATTGTGATGGTTGTTCTGATGGCTATCGCCTTCACACTTGCAACCCCATGGTTCCGGAGAAACAAGCTCAATTTGCCAAAGCCGTTAAAGAAGCTCACTGGGTTCAATGCCTTTTGGTATTCTCATCACCTTTTTGTCATCGTTTACACCCTGCTCATTGTGCATGGCCAATACCTTTACTTGACCAAAAAATGGTACAAGAAGACGACATGGATGTACTTGGCAATTCCAATTTGTCTTTATGCCACTGAGCGGTTGATTAGGGCACTGAGGTCAAGCATTAAGGCAGTTTCCATACAAAAGGTGGCTGTTTATCCTGGAAATGTGCTGGCTCTTCACATGTCAAAGCCAGATAGATTCAGATACAAGAGTGGGCAGTACATGTTTGTCAATTGTGCTGCTGTGTCCCCATTCGAATGGCACCCATTTTCAATAACTTCTGCCCCGGATGATGACTACCTCAGTGTTCACATTAGAACTCTTGGTGACTGGACTCGTCAACTCAGAACAGTTTTCTCAGAGGTATGCCGACCACCTCCAAACGGAATAAGTGGACTCCTCCGAGCCGAGGGACATAACAATCCTGATTTTCCTAGAGTTTTGATTGACGGTCCATATGGAGCTCCAGCACAAGACTACAAAGAGTATGAGGTGGTTTTATTAGTTGGTCTGGGAATTGGAGCAACTCCGATGATCAGCATTGTTAAAGACATAGTGAACAACATGAAAGCCATAGAGGAAGAAGAAGAAAATGATTTAGAAAACGGTCGTGACACCGGCGTTAACACAACATCATCATCATCGACAACAACCACGAGCCCTTCTTCTTCTGGACACAGAAGAAGGGACCAATTCAGGACAAGAAGAGCATACTTCTATTGGGTTACAAGAGAGCAAGGCTCGTTCGATTGGTTTAAGGGAGTGATGAATGAGGTGGCTGAATTGGACCACAACAATGTCATAGAGCTTCACAATTACTGCACCAGTGTTTATGAAGAAGGTGATGCTCGCTCAGCTCTCATTGCCATGCTTCAGTCCCTCAATCACGCCAAGAATGGCGTTGACGTTGTCTCTGGAACACGCGTTAAGTCACATTTCGCCAAGCCTAATTGGCGCAATGTGTACAAACGCGTTGCTCTCAATCACCCTGATTCTAGAGTTGGTGTTTTCTATTGCGGGGCACCGGCACTGACAAAAGAGCTACGACACCTAGCTTTGGATTTCTCTCACAAGACAAGCACCAAGTTTGATTTCCATAAAGAAAACTTCTAGATCAAGTCCCTCCTGATTTCCACCATTATATATCATCTCTTCCACTCCGTTTTCTCGTACAAAGCCTGTGGCATGGCCCACTGGCCCTTATGTTTATAGAAAAATCATATCAATATTTGTTTGGTACCCAGTTGATTTTGCTGCAAAATCACTAATAGAGAGCATTAGAAATATCAAGCGGACAAAGGTTGGTGGGTAGTTGATATCAAGGCCACACCACACTGGACACACAACACATGGCAAGGGAGATATAGGCCGAAAAAGGGGTTTAGCAAAAAAGTCATGCTCAGCCATTTCCTTTTGTTAAAAGTTGTGGTCCAAGCCAATAATTTTGTGAGAAATAGTAATAATGGCAGCCTGGCAGCCACCACTAATAATGGCAGCCTGGCAGCCACCACCAACTCAGTCCTTAACAGCCAAATGTAAAAGGGTTTTTGTTTTGTTTTCTTTTCTTTTTGGTTGGAGTAATTTGTTGTTTTATTTGATTAATTAAAGTTGCGATGTCAATTGAATGGGGTCGTAAGCCCTTTAAAATGTAAGTATGTATTGAATAATTAGTTCGGAGTACACTTTACCCAATTTCTTATGTTTC

这是我之前的引物
F1:ACACGTACGTTGTGA
R1:GAAACATAAGAAATTGGG


F2:ACACGTACGTTGTGAGTTGTGACCACTACTTTCCCACAAA
R2:GAAACATAAGAAATTGGGTAAAGTGTACTCCGAACTAATT
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dadaoxing

禁虫 (著名写手)


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-06 08:22:27
本帖内容被屏蔽

2楼2017-05-05 22:21:49
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匿名

木虫 (小有名气)

小志


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-06 08:22:45
本帖仅楼主可见
3楼2017-05-05 23:16:55
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匿名

用户注销 (正式写手)


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-06 08:23:03
本帖仅楼主可见

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4楼2017-05-05 23:42:26
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Cruiser肖

金虫 (正式写手)

酶要好,再一个,模板有没有问题

发自小木虫IOS客户端
5楼2017-05-05 23:49:18
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小布叮咚

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-07 22:16:46
饿的神啊: 金币+10, ★★★很有帮助 2017-05-10 17:14:23
引物和模板都没问题的情况下,调整温度有时作用不大,最好换个酶试试,效果立竿见影
happy
7楼2017-05-06 11:55:38
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饿的神啊

新虫 (著名写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 安志达天下 at 2017-05-05 23:16:55
第二对引物应该可以扩增出来,建议使用高保真酶扩增,延伸时间提高到三分钟试试

已使用takara的LA taq,延伸时间4分钟,依然只有引物二聚体,模板没有问题,是之前RACE时的反转录产物,并且做了正对照,条带清晰
11楼2017-05-07 20:50:39
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-07 22:16:35
引用回帖:
9楼: Originally posted by 饿的神啊 at 2017-05-07 15:12:24
模板没有问题,用的模板是之前做RACE的反转录产物,我稀释了用的,而且我拿别的引物做了对照,条带很亮...

BLAST没有找到别的接近全长的相似序列,除非样本来源跟参考序列一样,否则建议先从700-2300bp区间,甚至1300-2000bp区间,设计一对引物,最好是在保守区的,扩增测序,看看跟其他更接近,可能样本的跟你目前的参考序列不相似,这样选择目前的引物就不大可能从cDNA中扩增到目的序列。
为什么
12楼2017-05-07 20:52:29
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普通回帖

bestzdz

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-07 22:17:05
试试这个:
F: ACACGTACGTTGTGAGTTGTGAC
R: GAAACATAAGAAATTGGGTAAAGTGTACTC
学海无涯,乐在其中;谨言慎行,惜时自勉!
6楼2017-05-06 10:55:29
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饿的神啊

新虫 (著名写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 安志达天下 at 2017-05-05 23:16:55
第二对引物应该可以扩增出来,建议使用高保真酶扩增,延伸时间提高到三分钟试试

我是想先看看有没有条带,再换成高保真酶的,延伸时间都提到4分钟了,什么条带也没有啊
8楼2017-05-07 15:11:17
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饿的神啊

新虫 (著名写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by Cruiser肖 at 2017-05-05 23:49:18
酶要好,再一个,模板有没有问题

模板没有问题,用的模板是之前做RACE的反转录产物,我稀释了用的,而且我拿别的引物做了对照,条带很亮
9楼2017-05-07 15:12:24
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aaa0001984

至尊木虫 (正式写手)


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-07 22:18:05
换phusion polymerase之类具有长片段扩增能力的酶,普通的taq之类没这能力。而且你的PCR体系也要注意扩增时间,别还在合成片段呢,温度就开始95度进行下一个循环了

发自小木虫Android客户端
10楼2017-05-07 15:46:11
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