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扬花锡白

铜虫 (小有名气)

[求助] 融合PCR测序突变,但选择其他两个酶无法成功PCR 已有1人参与

各位朋友,最近在做融合PCR,片段全部都是用TAKARA公司Ex-Taq获得,但是测序发现会有突变,单个片段不是很长,都在1000多bp。但是TAKARA公司的Primestar以及宝赛公司的superpfu均无法获得目的片段,求各位出出主意,在此拜谢
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gyesang

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【答案】应助回帖

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扬花锡白: 金币+1, ★★★★★最佳答案 2017-05-03 23:18:44
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-05 16:16:35
Ex-Taq不适合扩增需要后续做融合PCR的片段,因为其还在3‘加A尾巴,导致基因突变。需用高保真酶进行PCR,至于高保真PCR酶你可以多试几个公司的。如果你是以质粒为模板进行PPCR,1000bp左右的片段,很容易扩增。
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2017-05-03 21:43:29
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扬花锡白

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2017-05-03 21:43:29
Ex-Taq不适合扩增需要后续做融合PCR的片段,因为其还在3‘加A尾巴,导致基因突变。需用高保真酶进行PCR,至于高保真PCR酶你可以多试几个公司的。如果你是以质粒为模板进行PPCR,1000bp左右的片段,很容易扩增。

最近刚发现这个问题,最近开始试试其他高保真酶

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3楼2017-05-03 23:16:28
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chenmx1257

新虫 (初入文坛)

这个如果有设计酶切位点,增加的那个A可以切掉,不会影响。主要还是看复制过程是否突变。

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4楼2017-05-23 22:15:06
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chenmx1257

新虫 (初入文坛)

takara的premix酶单位太少,我们实验室因此失败率很高。增加酶量有改善,不过感觉被欺骗。

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5楼2017-05-23 22:17:03
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