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lgsky

铜虫 (初入文坛)

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专业: 环境工程

[交流] DNA 提取

我是学环境的，最近导师让我从活性污泥中分离细菌，现在细菌分离出来几百个，但是不知道哪个是，只是从微生物形态学的角度对细菌大概区分了一下，现在还是剩下几十中，不能确定是那个是我们要的菌种，想通过提取dna的方法，经过pcr扩增，连接转化以后送去测序，但是在提取dna的过程中出现了问题，在用Tris饱和酚抽提的时候，混合后呈现粉红色，我加入过量的Tris饱和酚后，提取液也分成，出现红紫色上清液（不知道能不能这么叫），我做了一些对比实验，只有培养液与Tris饱和酚反映出现这种问题，其余试剂都没有出现这种现象。我初步我用来培养细菌的液体培养基里边还有的硫酸亚铁，经过灭菌以后，出现了三价铁（个人初步推算是，没有具体研究，因为液体培养基底部出现红褐色沉淀），随后我又用土壤用同样的方法提取了一遍dna，在跑电泳过程中，出现亮带，说明我试剂和药品没有问题，可能是培养基和酚发生反映。
现在我的问题有这么几个
1.培养基中的三价铁怎么去除，再去除的时候又不损害dna，
2.另外酸碱损害dna，有没有什么限度？比如加多少量，或者是在提取的时候先加NaOH还是在将细菌的细胞膜破裂以后再加，哪个效果好一点，我现在想用NaOH去除三价铁
3. 我怎么检验溶液中是否用三价铁
4.怎么能让硫酸亚铁在灭菌过程中尽可能少的出现三价铁（加酸？保证PH小？？
）
5. 细菌分离过程中，划线一般用什么工具，用接种环还是接种针？还是其他的什么东西
6. 在配置固体培养基的过程中，固体培养基老是呈现出半固体状态，就是30g/L的琼脂粉还是半固态，书上说一般是20g/L就可以了啊，配固体培养基应注意的主要事项都有什么
7.菌种的鉴别，常规的微生物检测的指标应该检验哪几项？
8. 以柠檬酸铁按为主要碳源的微生物，是不是他的体内也应该还有铁？强行离心或者是加NaOH再离心的话，会不会将细菌也离心出来了啊，这个是我比较关心的问题啊

问题就先这么多了啊，主要以前学的太少了啊，不太懂啊
稍后我把我用的方法附上，供大家参考

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