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neau-wangyan

铁虫 (初入文坛)

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[求助] 实时定量pcr中的internal是怎么回事已有1人参与

各位大牛，最近准备做血清样本中病毒的实时定量PCR，有别人给的实验方法和引物，但是发现protocol中，要检测同一个病毒序列上的不同区的两个片段，分别是FAM-TAMRA 和VIC-TAMRA 两条标记的探针。问了以前做定量PCR的人，说是internal对照。

问题1：始终不明白检测一条就可以证明该种病毒了啊，为什么要检测两条片段？

问题2：两条片段该用那一条算作是定量计算呢？

相关于internal的这个问题，看到一篇文献中在试验方法中是这样写的：

For the HDV internal control, a partial HDV sequence was internally modified and amplified by use of qRT-PCR to produce synthetic DNA, and the product was subcloned. For detection of the internal control, the probe was 5'-HEX– GCGATGGTGACTTTGTGGATAGTATCCTCA-3'-TAMRA. For the positive control for HDV, a region corresponding to nt 883–1265 was amplified, subcloned, and purified.

请问，这个文章中的internal control 又是什么意思，是要clone 制备标准品么？在同一个反应管中也要检测两个片段么？

还有一个问题，我做了几次实验，发现，目的片段，含量极低，第40个循环的时候曲线才刚刚抬头，我把循环数增加到55，才能看到完整的曲线，同时设有阴性对照和阳性对照，阴性对照什么都没有，想问一下，这样直接增加循环数，看到在40个循环看到起峰，目的片段，算是阳性么？

谢谢。

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1楼 2017-04-07 11:11:25

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neau-wangyan

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引用回帖:

4楼: Originally posted by skull123 at 2017-04-18 09:58:56
一般荧光定量PCR会有一条内标，用来做对照，目的是控制提取和扩增的成功，无论检测目标是否检测到，内标一定要正常起来。
然后荧光定量pcr40个ct才起来含量不是一般的低啊，现在一般的检测试剂盒最高也是以ct=35为 ...

是的，一般都会有个内参基因用于提取和扩增的评价，我看到有一篇文献用GAPDH做内参。但是有一点，这篇文章里所选择的那个片段，本身就是病毒的，如果没有感染，那肯定没有啊。为什么要用同一个病毒的两个不同的片段。
荧光定量pcr40个ct才起来是非常的低，但能说明它存在么？还是就是没有，为阴性结果？
谢谢