| 查看: 1603 | 回复: 5 | |||
neau-wangyan铁虫 (初入文坛)
|
[求助]
实时定量pcr中的internal是怎么回事 已有1人参与
|
|
各位大牛，最近准备做血清样本中病毒的实时定量PCR，有别人给的实验方法和引物，但是发现protocol中，要检测同一个病毒序列上的不同区的两个片段，分别是FAM-TAMRA 和VIC-TAMRA 两条标记的探针。问了以前做定量PCR的人，说是internal对照。 问题1：始终不明白检测一条就可以证明该种病毒了啊，为什么要检测两条片段？ 问题2：两条片段该用那一条算作是定量计算呢？ 相关于internal的这个问题，看到一篇文献中在试验方法中是这样写的： For the HDV internal control, a partial HDV sequence was internally modified and amplified by use of qRT-PCR to produce synthetic DNA, and the product was subcloned. For detection of the internal control, the probe was 5'-HEX– GCGATGGTGACTTTGTGGATAGTATCCTCA-3'-TAMRA. For the positive control for HDV, a region corresponding to nt 883–1265 was amplified, subcloned, and purified. 请问，这个文章中的internal control 又是什么意思，是要clone 制备标准品么？在同一个反应管中也要检测两个片段么？ 还有一个问题，我做了几次实验，发现，目的片段，含量极低，第40个循环的时候曲线才刚刚抬头，我把循环数增加到55，才能看到完整的曲线，同时设有阴性对照和阳性对照，阴性对照什么都没有，想问一下，这样直接增加循环数，看到在40个循环看到起峰，目的片段，算是阳性么？ 谢谢。  |
回复此楼» 猜你喜欢
285求调剂
已经有6人回复
-
085701环境工程求调剂
已经有6人回复
-
291求调剂
已经有6人回复
-
315分求调剂
已经有6人回复
-
277跪求调剂
已经有8人回复
-
295求调剂
已经有5人回复
-
295材料工程专硕求调剂
已经有3人回复
-
083000学硕274求调剂
已经有4人回复
-
275求调剂
已经有8人回复
-
一志愿211院校 344分 东北农业大学生物学学硕，求调剂
已经有8人回复
neau-wangyan
铁虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 6.8
- 红花: 2
- 帖子: 24
- 在线: 7.6小时
- 虫号: 1219772
- 注册: 2011-03-03
- 专业: 食品科学基础
2楼2017-04-18 07:43:20
我是骆驼
金虫 (正式写手)
- 应助: 28 (小学生)
- 金币: 2002.7
- 散金: 88
- 红花: 6
- 帖子: 400
- 在线: 63.9小时
- 虫号: 3894526
- 注册: 2015-05-27
- 专业: 微生物生态学
3楼2017-04-18 08:00:56
skull123
木虫 (正式写手)
- 应助: 33 (小学生)
- 金币: 1537.4
- 散金: 250
- 红花: 17
- 帖子: 503
- 在线: 150.1小时
- 虫号: 1207630
- 注册: 2011-02-21
- 专业: 病原微生物与感染研究与诊
【答案】应助回帖
|
一般荧光定量PCR会有一条内标，用来做对照，目的是控制提取和扩增的成功，无论检测目标是否检测到，内标一定要正常起来。 然后荧光定量pcr40个ct才起来含量不是一般的低啊，现在一般的检测试剂盒最高也是以ct=35为阴阳性分界点。 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
neau-wangyan4楼2017-04-18 09:58:56
neau-wangyan
铁虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 6.8
- 红花: 2
- 帖子: 24
- 在线: 7.6小时
- 虫号: 1219772
- 注册: 2011-03-03
- 专业: 食品科学基础
5楼2017-04-25 06:47:34
neau-wangyan
铁虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 6.8
- 红花: 2
- 帖子: 24
- 在线: 7.6小时
- 虫号: 1219772
- 注册: 2011-03-03
- 专业: 食品科学基础
6楼2017-04-25 06:49:49
