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caiqingchong木虫 (著名写手)
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[交流]
关于sacⅠ 和 EcoRⅠ双酶切的问题
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这今天在克隆一个基因，大约1.7k，开始pcr完了后直接胶回收，双酶切，用的是MBI的酶，按照其网站的推荐，先在1x tango buffer里用Sac1酶切一段时间后，再加buffer至2x，同时加一定量的 EcoRⅠ，再酶切一段时间（网站要求酶切1h，而我延长至数倍），在胶回收跑电泳时发现，那个溴酚蓝的指示带扩散非常厉害，而DNA片段扩散也很严重，根本无法回收，做了几次都这样，排除了凝胶、上样buffer等原因，因为回收其他的都很好。 几天又直接把DNA片段连接到了PMD-T载体上，提质粒后用上面的方法双酶切胶回收，还是一样的问题，溴酚蓝和DNA扩散的都很严重，到底是什么原因啊，是酶切时间太长了吗，还是怎么回事？ 碰到此问题或懂行的xdjm来解释或分析一下，谢谢了！ |
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