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xuhuichen

银虫 (正式写手)

[求助] 仅用LB-Amp平板,不用IPTG 和 X-gal 如何筛选菌落?? 请解答啊已有1人参与

在做DGGE时,切胶回收后的条带需进行TA克隆提高其测序效率, 将纯化后的 PCR扩增产物与 pGEM-T Easy Vector 克隆载体连接、转化 E.coli DH5α感受态细胞。利用涂布了 IPTG 和 X-gal 的 LB 平板(氨苄青霉素),“蓝白斑”筛选阳性克隆。
      我想请问如果不蓝白斑筛选,只在LB 平板(氨苄青霉素)上做筛选,步骤是怎样的呢?筛选什么样的菌落才合适呢?@hc-material@gyesang
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绝对零度的笑

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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xuhuichen: 金币+15, ★★★很有帮助 2017-04-06 08:56:19
做板子的时候Amp用量加倍,涂上去长过夜,随便挑克隆就行,可以多挑几个一起验证。我基本上就没用过蓝白斑筛选,觉得麻烦
2楼2017-04-06 00:52:00
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xuhuichen

银虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 绝对零度的笑 at 2017-04-06 00:52:00
做板子的时候Amp用量加倍,涂上去长过夜,随便挑克隆就行,可以多挑几个一起验证。我基本上就没用过蓝白斑筛选,觉得麻烦

非常感谢,我还有疑问,Amp用量加倍,量多少合适呢?加多了会抑制生长的吧。随便挑克隆就行指的是挑取不同菌落形态的吗,代表不同的菌?怎么验证呢?
3楼2017-04-06 08:49:54
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liuyuexinfei

木虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 绝对零度的笑 at 2017-04-06 00:52:00
做板子的时候Amp用量加倍,涂上去长过夜,随便挑克隆就行,可以多挑几个一起验证。我基本上就没用过蓝白斑筛选,觉得麻烦

我也是这么搞

发自小木虫Android客户端
我选择,我喜欢;我喜欢我的选择。
4楼2017-04-06 16:47:48
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liuyuexinfei

木虫 (著名写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by xuhuichen at 2017-04-06 08:49:54
非常感谢,我还有疑问,Amp用量加倍,量多少合适呢?加多了会抑制生长的吧。随便挑克隆就行指的是挑取不同菌落形态的吗,代表不同的菌?怎么验证呢?...

你难道不做pcr验证和测序么?

发自小木虫Android客户端
我选择,我喜欢;我喜欢我的选择。
5楼2017-04-06 16:48:57
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哦嗯啊

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
xuhuichen: 金币+10 2017-04-07 09:07:53
一般在培养基中加入AMP,使其终浓度为 100μg/ml ,然后在超净台上铺平板,备用。
然后就正常的涂平板,过夜培养。
如果长出来后,一般挑选比较圆的或者大的菌落做菌落PCR检测,或者提质粒酶切检测
最后测序检测确认
6楼2017-04-06 22:19:18
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绝对零度的笑

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by xuhuichen at 2017-04-06 08:49:54
非常感谢,我还有疑问,Amp用量加倍,量多少合适呢?加多了会抑制生长的吧。随便挑克隆就行指的是挑取不同菌落形态的吗,代表不同的菌?怎么验证呢?...

Amp我都加到200ug/ml,Amp加多了问题不大,顶多出菌落晚点罢了。只要你的板子没问题,不长成一大片菌苔就能挑菌落。菌落形态不是很影响克隆阳性率,我挑过阴性大克隆,也挑过阳性小克隆,不过还是饱满一些的克隆阳性率会高一些。验证你用PCR或者酶切都行,酶切结果比较准确,也相对麻烦一些,因为要抽质粒。我一般是摇起来做菌液PCR验证。
7楼2017-04-06 23:36:57
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xuhuichen

银虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by liuyuexinfei at 2017-04-06 16:48:57
你难道不做pcr验证和测序么?
...

做的,我明白了,谢谢
8楼2017-04-07 09:06:49
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xuhuichen

银虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 哦嗯啊 at 2017-04-06 22:19:18
一般在培养基中加入AMP,使其终浓度为 100μg/ml ,然后在超净台上铺平板,备用。
然后就正常的涂平板,过夜培养。
如果长出来后,一般挑选比较圆的或者大的菌落做菌落PCR检测,或者提质粒酶切检测
最后测序检测 ...

非常感谢!做菌落PCR检测的是要买相应的试剂盒提取菌落DNA吗?我知道质粒酶切需要质粒试剂盒的?
9楼2017-04-07 09:45:37
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xuhuichen

银虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 绝对零度的笑 at 2017-04-06 23:36:57
Amp我都加到200ug/ml,Amp加多了问题不大,顶多出菌落晚点罢了。只要你的板子没问题,不长成一大片菌苔就能挑菌落。菌落形态不是很影响克隆阳性率,我挑过阴性大克隆,也挑过阳性小克隆,不过还是饱满一些的克隆阳 ...

我还没有开始做克隆,在LB 平板(氨苄青霉素)出现的阴阳性克隆菌落有什么区别啊?只是外形大小的问题吗,还是有颜色的区别?摇起来做菌液PCR验证是先要提取菌落DNA 吗?要买相应的试剂盒吗
10楼2017-04-07 09:49:25
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