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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » 仅用LB-Amp平板，不用IPTG 和 X-gal 如何筛选菌落?? 请解答啊
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xuhuichen

银虫 (正式写手)

[求助] 仅用LB-Amp平板，不用IPTG 和 X-gal 如何筛选菌落?? 请解答啊 已有1人参与

在做DGGE时，切胶回收后的条带需进行TＡ克隆提高其测序效率, 将纯化后的 PCR扩增产物与 pGEM-T Easy Vector 克隆载体连接、转化 E.coli DH5α感受态细胞。利用涂布了 IPTG 和 X-gal 的 LB 平板（氨苄青霉素），“蓝白斑”筛选阳性克隆。
      我想请问如果不蓝白斑筛选，只在LB 平板（氨苄青霉素）上做筛选，步骤是怎样的呢？筛选什么样的菌落才合适呢？@hc-material@gyesang
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1楼 2017-04-05 19:10:12
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绝对零度的笑

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xuhuichen: 金币+15, ★★★很有帮助 2017-04-06 08:56:19
做板子的时候Amp用量加倍，涂上去长过夜，随便挑克隆就行，可以多挑几个一起验证。我基本上就没用过蓝白斑筛选，觉得麻烦
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2楼2017-04-06 00:52:00
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xuhuichen

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 绝对零度的笑 at 2017-04-06 00:52:00
做板子的时候Amp用量加倍，涂上去长过夜，随便挑克隆就行，可以多挑几个一起验证。我基本上就没用过蓝白斑筛选，觉得麻烦

非常感谢，我还有疑问，Amp用量加倍，量多少合适呢？加多了会抑制生长的吧。随便挑克隆就行指的是挑取不同菌落形态的吗，代表不同的菌？怎么验证呢？
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3楼2017-04-06 08:49:54
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liuyuexinfei

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 绝对零度的笑 at 2017-04-06 00:52:00
做板子的时候Amp用量加倍，涂上去长过夜，随便挑克隆就行，可以多挑几个一起验证。我基本上就没用过蓝白斑筛选，觉得麻烦

我也是这么搞

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我选择，我喜欢；我喜欢我的选择。
4楼2017-04-06 16:47:48
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liuyuexinfei

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xuhuichen at 2017-04-06 08:49:54
非常感谢，我还有疑问，Amp用量加倍，量多少合适呢？加多了会抑制生长的吧。随便挑克隆就行指的是挑取不同菌落形态的吗，代表不同的菌？怎么验证呢？...

你难道不做pcr验证和测序么？

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我选择，我喜欢；我喜欢我的选择。
5楼2017-04-06 16:48:57
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哦嗯啊

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xuhuichen: 金币+10 2017-04-07 09:07:53
一般在培养基中加入AMP，使其终浓度为 100μg/ml ，然后在超净台上铺平板，备用。
然后就正常的涂平板，过夜培养。
如果长出来后，一般挑选比较圆的或者大的菌落做菌落PCR检测，或者提质粒酶切检测
最后测序检测确认
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6楼2017-04-06 22:19:18
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绝对零度的笑

木虫 (正式写手)
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3楼: Originally posted by xuhuichen at 2017-04-06 08:49:54
非常感谢，我还有疑问，Amp用量加倍，量多少合适呢？加多了会抑制生长的吧。随便挑克隆就行指的是挑取不同菌落形态的吗，代表不同的菌？怎么验证呢？...

Amp我都加到200ug/ml，Amp加多了问题不大，顶多出菌落晚点罢了。只要你的板子没问题，不长成一大片菌苔就能挑菌落。菌落形态不是很影响克隆阳性率，我挑过阴性大克隆，也挑过阳性小克隆，不过还是饱满一些的克隆阳性率会高一些。验证你用PCR或者酶切都行，酶切结果比较准确，也相对麻烦一些，因为要抽质粒。我一般是摇起来做菌液PCR验证。
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7楼2017-04-06 23:36:57
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xuhuichen

银虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by liuyuexinfei at 2017-04-06 16:48:57
你难道不做pcr验证和测序么？
...

做的，我明白了，谢谢
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8楼2017-04-07 09:06:49
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xuhuichen

银虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 哦嗯啊 at 2017-04-06 22:19:18
一般在培养基中加入AMP，使其终浓度为 100μg/ml ，然后在超净台上铺平板，备用。
然后就正常的涂平板，过夜培养。
如果长出来后，一般挑选比较圆的或者大的菌落做菌落PCR检测，或者提质粒酶切检测
最后测序检测 ...

非常感谢！做菌落PCR检测的是要买相应的试剂盒提取菌落DNA吗？我知道质粒酶切需要质粒试剂盒的?
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9楼2017-04-07 09:45:37
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xuhuichen

银虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 绝对零度的笑 at 2017-04-06 23:36:57
Amp我都加到200ug/ml，Amp加多了问题不大，顶多出菌落晚点罢了。只要你的板子没问题，不长成一大片菌苔就能挑菌落。菌落形态不是很影响克隆阳性率，我挑过阴性大克隆，也挑过阳性小克隆，不过还是饱满一些的克隆阳 ...

我还没有开始做克隆，在LB 平板（氨苄青霉素）出现的阴阳性克隆菌落有什么区别啊？只是外形大小的问题吗，还是有颜色的区别？摇起来做菌液PCR验证是先要提取菌落DNA 吗？要买相应的试剂盒吗
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10楼2017-04-07 09:49:25
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