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[求助]
求助各位虫友！！简并引物调取单克隆抗体重链可变区基因失败 已有1人参与
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从今年1月开始，一直在用师姐给的cDNA模板和简并引物调取单抗的可变区基因，2月开学后成功调取到轻链VL的基因，但重链一直失败，在经历大概十次失败后，比对这几次的测序结果发现，调出的序列基本都是一个东西，却不是重链基因。此时，开始考虑模板可能有问题，因为pcr的结果就像图1和图2中所显示的那样，总是有杂带，虽然有300-400bp之间的目的条带，但是胶回收送去测序以后发现不是重链的基因。 于是上周在重新提取RNA逆转录cDNA后，利用新模板进行pcr，结果是轻链VL一次成功，但重链利用pfu酶和taq酶各PCR两次后仍然失败。 期间针对两种酶做了温度梯度pcr，结果如图3-6.选择pfu酶50和55度产物送去测序结果任然是失败。之前一直使用的是56度。 简并引物如下：上游：GGRSCTGMRYTGGTGARGCCTGG 下游：GGAGACDGTGASMRKRGTSCCTTGGC 请各位虫友帮忙看下哪些地方可能出错，提点建议让我的实验可以进行下去。谢谢！！  图1：2017.02.22 重链PCR(Taq酶、pfu酶).jpg  图2：2017.03.12 重链PCR.jpg  图3：2017.03.28 重链Taq温度梯度PCR（63-58）.jpg  图4;2017.03.28 重链 pfu温度梯度PCR（63-58）.jpg  图5：2017.03.29 重链 pfu温度梯度PCR（55-50）.jpg  图6：2017.03.29 重链 Taq温度梯度PCR（55-50）.jpg |
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