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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助各位虫友！！简并引物调取单克隆抗体重链可变区基因失败
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iioowt

金虫 (初入文坛)

[求助] 求助各位虫友！！简并引物调取单克隆抗体重链可变区基因失败 已有1人参与

从今年1月开始，一直在用师姐给的cDNA模板和简并引物调取单抗的可变区基因，2月开学后成功调取到轻链VL的基因，但重链一直失败，在经历大概十次失败后，比对这几次的测序结果发现，调出的序列基本都是一个东西，却不是重链基因。此时，开始考虑模板可能有问题，因为pcr的结果就像图1和图2中所显示的那样，总是有杂带，虽然有300-400bp之间的目的条带，但是胶回收送去测序以后发现不是重链的基因。
       于是上周在重新提取RNA逆转录cDNA后，利用新模板进行pcr，结果是轻链VL一次成功，但重链利用pfu酶和taq酶各PCR两次后仍然失败。
       期间针对两种酶做了温度梯度pcr，结果如图3-6.选择pfu酶50和55度产物送去测序结果任然是失败。之前一直使用的是56度。
      简并引物如下：上游：GGRSCTGMRYTGGTGARGCCTGG  
                               下游：GGAGACDGTGASMRKRGTSCCTTGGC
       请各位虫友帮忙看下哪些地方可能出错，提点建议让我的实验可以进行下去。谢谢！！

求助各位虫友！！简并引物调取单克隆抗体重链可变区基因失败
图1：2017.02.22 重链PCR(Taq酶、pfu酶).jpg


求助各位虫友！！简并引物调取单克隆抗体重链可变区基因失败-1
图2：2017.03.12 重链PCR.jpg


求助各位虫友！！简并引物调取单克隆抗体重链可变区基因失败-2
图3：2017.03.28  重链Taq温度梯度PCR（63-58）.jpg


求助各位虫友！！简并引物调取单克隆抗体重链可变区基因失败-3
图4;2017.03.28 重链 pfu温度梯度PCR（63-58）.jpg


求助各位虫友！！简并引物调取单克隆抗体重链可变区基因失败-4
图5：2017.03.29 重链 pfu温度梯度PCR（55-50）.jpg


求助各位虫友！！简并引物调取单克隆抗体重链可变区基因失败-5
图6：2017.03.29 重链 Taq温度梯度PCR（55-50）.jpg
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1楼 2017-03-30 23:01:45
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sunshine436

新虫 (小有名气)
楼主做出来吗？想问问楼主用的什么引物做的反转录，谢谢

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2楼2017-05-17 07:52:02
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

换个引物试试吧，你可以做个巢式，先把你要的大序列吊出来。
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采菊东篱下，悠然见南山。
3楼2017-05-17 07:58:09
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

PCR这东西，你想快点成功，就引物多设计点。
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iioowt
采菊东篱下，悠然见南山。
4楼2017-05-17 07:59:41
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马美哥哥

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 781055707 at 2017-05-17 07:58:09
换个引物试试吧，你可以做个巢式，先把你要的大序列吊出来。

你好，巢式的体系是什么

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5楼2017-10-13 00:01:22
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马美哥哥

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
1楼: Originally posted by iioowt at 2017-03-30 23:01:45
从今年1月开始，一直在用师姐给的cDNA模板和简并引物调取单抗的可变区基因，2月开学后成功调取到轻链VL的基因，但重链一直失败，在经历大概十次失败后，比对这几次的测序结果发现，调出的序列基本都是一个东西，却不 ...

你好，你是一个一个用一半pcr扩的吗

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6楼2017-10-13 00:02:29
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iioowt

金虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by 781055707 at 2017-05-17 07:59:41
PCR这东西，你想快点成功，就引物多设计点。

是的，换了引物就做出来了

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7楼2017-11-13 20:02:20
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iioowt

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sunshine436 at 2017-05-17 07:52:02
楼主做出来吗？想问问楼主用的什么引物做的反转录，谢谢

反转录用的试剂盒操作的，天根和康为都可以

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8楼2017-11-13 20:03:06
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iioowt

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 马美哥哥 at 2017-10-13 00:02:29
你好，你是一个一个用一半pcr扩的吗
...

没有，就是做的普通PCR

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9楼2017-11-13 20:04:24
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iioowt

金虫 (初入文坛)
最后换了引物做出来了，感觉这东西还是和引物有关。可以借鉴已发表的论文里的引物

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10楼2017-11-13 20:04:34
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