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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 基因全长验证
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洛神惟惟

新虫 (正式写手)

[求助] 基因全长验证 已有3人参与

用高保真酶做基因全长验证时，一开始全都是拖带，后来改变条件后，跑出条带了，却不是我的目的带，因为我的目的带只有393bp左右，跑出的条带有将近600bp，请问大家有谁遇到过这种情况以及遇到这种情况该如何解决，谢谢@biostar2009
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1楼 2017-03-25 22:08:30
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莫等闲111

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【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-03-27 06:32:36
跑出的条带有将近600bp是引物二聚体，事实上你的条带并没有跑出来；个人建议：模板浓度要合适不要过多也不要过少，自己计算好；另外退火温度自己最好做一个梯度。
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4楼2017-03-26 12:10:28
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洛神惟惟

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 莫等闲111 at 2017-03-26 12:10:28
跑出的条带有将近600bp是引物二聚体，事实上你的条带并没有跑出来；个人建议：模板浓度要合适不要过多也不要过少，自己计算好；另外退火温度自己最好做一个梯度。

600bp都是引物二聚体吗？不能够吧，引物二聚体一般不都是在100bp左右吗

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5楼2017-03-26 12:15:30
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你扩增的引物是cDNA水平还是基因组水平的，如用cDNA水平的引物 且基因组有内含子，得到的就是比在cDNA上的大小要大，如果是用基因组水平的引物做验证，拖带表示引物的特异性不好，重新设计引物或者试试做touchdown PCR，具体怎么做百度或者问问你师兄师姐。
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。
10楼2017-03-26 23:36:20
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洛神惟惟

新虫 (正式写手)
求大神

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2楼2017-03-26 12:04:10
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洛神惟惟

新虫 (正式写手)
求大神

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3楼2017-03-26 12:04:48
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莫等闲111

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5楼: Originally posted by 洛神惟惟 at 2017-03-26 12:15:30
600bp都是引物二聚体吗？不能够吧，引物二聚体一般不都是在100bp左右吗
...

另外你试试将延伸时间增加点。
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6楼2017-03-26 12:20:47
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洛神惟惟

新虫 (正式写手)
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6楼: Originally posted by 莫等闲111 at 2017-03-26 12:20:47
另外你试试将延伸时间增加点。...

增加延伸时间吗，这个原理是什么呀

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7楼2017-03-26 16:44:48
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莫等闲111

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7楼: Originally posted by 洛神惟惟 at 2017-03-26 16:44:48
增加延伸时间吗，这个原理是什么呀
...

因为你跑出的条带有将近600bp，有可能是延伸时间不够，所以可以稍微延长点时间。
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8楼2017-03-26 16:46:15
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洛神惟惟

新虫 (正式写手)
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8楼: Originally posted by 莫等闲111 at 2017-03-26 16:46:15
因为你跑出的条带有将近600bp，有可能是延伸时间不够，所以可以稍微延长点时间。...

可是我的延伸时间已经是一分钟了，目的带只有400bp，还要再增加延伸时间吗？这个我真不理解，您可以详细解答一下吗？

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9楼2017-03-26 18:31:06
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