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南方科技大学公共卫生及应急管理学院2026级博士研究生招生报考通知(长期有效)
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洛神惟惟

新虫 (正式写手)

[求助] 基因全长验证已有3人参与

用高保真酶做基因全长验证时,一开始全都是拖带,后来改变条件后,跑出条带了,却不是我的目的带,因为我的目的带只有393bp左右,跑出的条带有将近600bp,请问大家有谁遇到过这种情况以及遇到这种情况该如何解决,谢谢@biostar2009
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莫等闲111

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【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-03-27 06:32:36
跑出的条带有将近600bp是引物二聚体,事实上你的条带并没有跑出来;个人建议:模板浓度要合适不要过多也不要过少,自己计算好;另外退火温度自己最好做一个梯度。
站内信:http:///muchong.com/bbs/box.php评分及查找应助者发送的密码http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=7465070&fpage=1
4楼2017-03-26 12:10:28
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洛神惟惟

新虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 莫等闲111 at 2017-03-26 12:10:28
跑出的条带有将近600bp是引物二聚体,事实上你的条带并没有跑出来;个人建议:模板浓度要合适不要过多也不要过少,自己计算好;另外退火温度自己最好做一个梯度。

600bp都是引物二聚体吗?不能够吧,引物二聚体一般不都是在100bp左右吗

发自小木虫Android客户端
5楼2017-03-26 12:15:30
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你扩增的引物是cDNA水平还是基因组水平的,如用cDNA水平的引物 且基因组有内含子,得到的就是比在cDNA上的大小要大,如果是用基因组水平的引物做验证,拖带表示引物的特异性不好,重新设计引物或者试试做touchdown PCR,具体怎么做百度或者问问你师兄师姐。
10楼2017-03-26 23:36:20
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普通回帖

洛神惟惟

新虫 (正式写手)

2楼2017-03-26 12:04:10
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洛神惟惟

新虫 (正式写手)

3楼2017-03-26 12:04:48
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莫等闲111

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引用回帖:
5楼: Originally posted by 洛神惟惟 at 2017-03-26 12:15:30
600bp都是引物二聚体吗?不能够吧,引物二聚体一般不都是在100bp左右吗
...

另外你试试将延伸时间增加点。
站内信:http:///muchong.com/bbs/box.php评分及查找应助者发送的密码http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=7465070&fpage=1
6楼2017-03-26 12:20:47
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洛神惟惟

新虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 莫等闲111 at 2017-03-26 12:20:47
另外你试试将延伸时间增加点。...

增加延伸时间吗,这个原理是什么呀

发自小木虫Android客户端
7楼2017-03-26 16:44:48
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莫等闲111

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引用回帖:
7楼: Originally posted by 洛神惟惟 at 2017-03-26 16:44:48
增加延伸时间吗,这个原理是什么呀
...

因为你跑出的条带有将近600bp,有可能是延伸时间不够,所以可以稍微延长点时间。
站内信:http:///muchong.com/bbs/box.php评分及查找应助者发送的密码http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=7465070&fpage=1
8楼2017-03-26 16:46:15
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洛神惟惟

新虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 莫等闲111 at 2017-03-26 16:46:15
因为你跑出的条带有将近600bp,有可能是延伸时间不够,所以可以稍微延长点时间。...

可是我的延伸时间已经是一分钟了,目的带只有400bp,还要再增加延伸时间吗?这个我真不理解,您可以详细解答一下吗?

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9楼2017-03-26 18:31:06
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