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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 基因克隆，紧急求助！
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villyw

金虫 (初入文坛)

[交流] 基因克隆，紧急求助！

1、将PCR产物酶切后与同样酶切的载体连接，同样条件做了一个载体自连的阴性对照，可是转化后的平板上载体自连的阴性对照比克隆目的基因的连接菌斑数目多好几倍，请问这是为什么啊？
2、将上述目的基因的连接菌斑做菌落PCR或提质粒酶切很难出现阳性克隆，这又是为什么呢？
如蒙各位赐教，不胜感激！谢谢！
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1楼 2008-12-28 23:50:43
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villyw

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by darkblue111 at 2008-12-29 14:33:
估计是引物的5'端不保真，酶切位点被破坏，切不动

谢谢darkblue111！
我是用takara PrimeSTARTM HS DNA polymerase扩的，它是一种高保真酶。会不会其末端形成高级结构？
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9楼2008-12-29 22:08:06
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lipishun

金虫 (小有名气)
体系构建好了吗？
载体是否酶切完全？
比例怎么样？
建议过量酶切载体，用碱性磷酸酶处理。目的片段与载体1：1-1：5连接！
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2楼2008-12-28 23:53:31
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villyw

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by lipishun at 2008-12-28 23:53:
体系构建好了吗？
载体是否酶切完全？
比例怎么样？
建议过量酶切载体，用碱性磷酸酶处理。目的片段与载体1：1-1：5连接！

谢谢Lipishun的回答！
体系是PCR产物1-2微克，载体1-2微克，37度过夜。
电泳显示载体酶切完全。连接目的片段与载体8：1或更高。
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3楼2008-12-29 00:33:43
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户
是单酶切还是双酶切？如果是双切的话电泳不一定能确定你切好了。要是只是克隆的话改用市售的T载体会好很多。
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金币是赌出来的
5楼2008-12-29 09:21:20
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