应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 基因克隆，紧急求助！
91/1返回列表
查看: 519  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。

villyw

金虫 (初入文坛)

[交流] 基因克隆，紧急求助！

1、将PCR产物酶切后与同样酶切的载体连接，同样条件做了一个载体自连的阴性对照，可是转化后的平板上载体自连的阴性对照比克隆目的基因的连接菌斑数目多好几倍，请问这是为什么啊？
2、将上述目的基因的连接菌斑做菌落PCR或提质粒酶切很难出现阳性克隆，这又是为什么呢？
如蒙各位赐教，不胜感激！谢谢！
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2008-12-28 23:50:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lipishun

金虫 (小有名气)
体系构建好了吗？
载体是否酶切完全？
比例怎么样？
建议过量酶切载体，用碱性磷酸酶处理。目的片段与载体1：1-1：5连接！
赞一下 回复此楼
2楼2008-12-28 23:53:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

villyw

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by lipishun at 2008-12-28 23:53:
体系构建好了吗？
载体是否酶切完全？
比例怎么样？
建议过量酶切载体，用碱性磷酸酶处理。目的片段与载体1：1-1：5连接！

谢谢Lipishun的回答！
体系是PCR产物1-2微克，载体1-2微克，37度过夜。
电泳显示载体酶切完全。连接目的片段与载体8：1或更高。
赞一下 回复此楼
3楼2008-12-29 00:33:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaocy8903

木虫 (知名作家)
碱性磷酸酶处理
回复此楼
4楼2008-12-29 08:51:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户
是单酶切还是双酶切？如果是双切的话电泳不一定能确定你切好了。要是只是克隆的话改用市售的T载体会好很多。
赞一下 回复此楼
金币是赌出来的
5楼2008-12-29 09:21:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

36678293

铜虫 (正式写手)
如果需要帮助，可以加我QQ：36678293，我会给你帮助，并且帮助你详细解答
！
赞一下 回复此楼
6楼2008-12-29 12:49:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

darkblue111

铜虫 (初入文坛)
估计是引物的5'端不保真，酶切位点被破坏，切不动
赞一下 回复此楼
7楼2008-12-29 14:33:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

darkblue111

铜虫 (初入文坛)
估计是引物的5'端不保真，酶切位点被破坏，切不动
赞一下 回复此楼
8楼2008-12-29 16:49:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

villyw

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by darkblue111 at 2008-12-29 14:33:
估计是引物的5'端不保真，酶切位点被破坏，切不动

谢谢darkblue111！
我是用takara PrimeSTARTM HS DNA polymerase扩的，它是一种高保真酶。会不会其末端形成高级结构？
赞一下 回复此楼
9楼2008-12-29 22:08:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 villyw 的主题更新
91/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-05 4/200 2026-11-05 23:39 by qL1cU46YIdK0
[基金申请] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 9/450 2026-11-05 23:28 by qL1cU46YIdK0
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 6/300 2026-11-05 23:08 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 kvewwGtKktqB 2026-11-04 9/450 2026-11-05 22:55 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +6 kvewwGtKktqB 2026-11-04 14/700 2026-11-05 22:46 by qL1cU46YIdK0
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +5 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 13/650 2026-11-05 22:44 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +6 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 15/750 2026-11-05 22:44 by qL1cU46YIdK0
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +6 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 11/550 2026-11-05 22:35 by qL1cU46YIdK0
[公派出国] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +7 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 20/1000 2026-11-05 22:33 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +7 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 17/850 2026-11-05 22:24 by qL1cU46YIdK0
[公派出国] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-05 3/150 2026-11-05 21:05 by qL1cU46YIdK0
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 8/400 2026-11-05 20:23 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 8/400 2026-11-05 20:21 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +6 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 9/450 2026-11-05 20:10 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 6/300 2026-11-05 18:00 by My20PsvIExYO
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 13/650 2026-11-05 17:15 by My20PsvIExYO
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 9/450 2026-11-05 15:46 by My20PsvIExYO
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 9/450 2026-11-05 15:13 by My20PsvIExYO
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 10/500 2026-11-05 10:39 by PYZmcHr5kSaq
[基金申请] 各位基础老师们，看完中央《从严治党》的决定后，对学术界更加有信心了吧 +5 iaeyuan 2026-11-01 5/250 2026-11-04 14:43 by jinchengzi
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭