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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助 重叠PCR 产物中的缺失了碱基
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卡拉

新虫 (初入文坛)

[交流] 求助 重叠PCR 产物中的缺失了碱基

我用重叠PCR的方法 融合了两个基因  长度分别为45 和 1740  可测序回来以后长的那个基因缺失了 36个bp  其它位置完全正确  缺的位置又不是两个基因重叠的部分 是长基因的中间的位置  接下来我又做了几次  可测序结果都是缺那30几个bp  缺的位置起始位置相同 终止的位置有几个bp的浮动  缺的位置的碱基GC含量极为的高  将近90%  求大家 帮帮我  我都做了几个月了 总是缺那些碱基 我都要疯了  郁闷之极  有找不到办法解决   求求大家指点我一下  我在这里先谢谢大家了  要不这个年 就要在郁闷中度过了
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1楼 2008-12-27 23:54:11
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月月大可

木虫 (著名写手)
★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论~
我曾经也用重叠PCR方法把一个启动子和一个功能基因连接在一起，在第二个片段的末尾部分也出现了你描述的这种情况，没有少30多个，少了10几个，也说不清楚原因。我的第二个片段也很长，在1.6K左右。
但是我也见过其他人用重叠PCR将8个片段连接起来的，人家的就很正常。不过8个片段都是比较短的那种，总长还不到1K。
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2楼2008-12-28 08:56:24
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卡拉

新虫 (初入文坛)
我上一界的师姐  也是用重叠PCR的方法 双点突变 也是跟我做的相同基因 也是缺了那36了 这到底是为什么呢
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3楼2008-12-28 22:06:03
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lliu

新虫 (小有名气)
应当不是Overlap PCR的问题。（我猜）由可能是你的序列在转入E coli里发生了同源重组后缺失。建议用RecA缺陷的E coli试试看。
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4楼2008-12-29 02:06:25
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卡拉

新虫 (初入文坛)
谢谢楼上的  你说的有道理  可我在想 是不是我PCR的过程中就丢失了呢 ?  缺失那段的GC含量很高  我想下次用GC buffer 试试 可我的退火温度该如何选择呢?  模板本身的退后温度并不高  就是50度左右  而缺失的那段的 GC含量 就高多了 那我的退火的温度该如何选择? 请大家帮帮忙.
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5楼2008-12-29 23:50:31
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卡拉

新虫 (初入文坛)
谢谢楼上的  你说的有道理  可我在想 是不是我PCR的过程中就丢失了呢 ?  缺失那段的GC含量很高  我想下次用GC buffer 试试 可我的退火温度该如何选择呢?  模板本身的退后温度并不高  就是50度左右  而缺失的那段的 GC含量 就高多了 那我的退火的温度该如何选择? 请大家帮帮忙.
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6楼2008-12-29 23:51:24
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qgaoamtf

至尊木虫 (职业作家)
试一下TakaLa的全基因合成吧！
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7楼2008-12-30 00:04:09
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swordhang

金虫 (小有名气)
那你把1740的测已下看一下，是不是在重叠之前就已丢了
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8楼2008-12-30 00:17:47
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卡拉

新虫 (初入文坛)
我已经拿去测序了 我是在别人T载体的模板上扩的我要的序列  别人的已经拿去测序了 是对的 现在我也不是很清楚 是从哪一部就开始缺了 因为重叠PCR的步骤要多些  PCR的次数也多  我在把两个模板重叠在一起PCR的时候 先没有加拉通引物  指加了pfu mix 酶 让他反应10个循环后在加的上下游的拉通引物  ,是不是 这部缺的碱基啊?  还是哪步缺的?. 我真是郁闷了
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9楼2008-12-30 13:54:52
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卡拉

新虫 (初入文坛)
我已经拿去测序了 我是在别人T载体的模板上扩的我要的序列  别人的已经拿去测序了 是对的 现在我也不是很清楚 是从哪一部就开始缺了 因为重叠PCR的步骤要多些  PCR的次数也多  我在把两个模板重叠在一起PCR的时候 先没有加拉通引物  指加了pfu mix 酶 让他反应10个循环后在加的上下游的拉通引物  ,是不是 这部缺的碱基啊?  还是哪步缺的?. 我真是郁闷了
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10楼2008-12-30 13:55:48
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