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卡拉

新虫 (初入文坛)

[交流] 求助 重叠PCR 产物中的缺失了碱基

我用重叠PCR的方法 融合了两个基因  长度分别为45 和 1740  可测序回来以后长的那个基因缺失了 36个bp  其它位置完全正确  缺的位置又不是两个基因重叠的部分 是长基因的中间的位置  接下来我又做了几次  可测序结果都是缺那30几个bp  缺的位置起始位置相同 终止的位置有几个bp的浮动  缺的位置的碱基GC含量极为的高  将近90%  求大家 帮帮我  我都做了几个月了 总是缺那些碱基 我都要疯了  郁闷之极  有找不到办法解决   求求大家指点我一下  我在这里先谢谢大家了  要不这个年 就要在郁闷中度过了
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卡拉

新虫 (初入文坛)

我已经拿去测序了 我是在别人T载体的模板上扩的我要的序列  别人的已经拿去测序了 是对的 现在我也不是很清楚 是从哪一部就开始缺了 因为重叠PCR的步骤要多些  PCR的次数也多  我在把两个模板重叠在一起PCR的时候 先没有加拉通引物  指加了pfu mix 酶 让他反应10个循环后在加的上下游的拉通引物  ,是不是 这部缺的碱基啊?  还是哪步缺的?. 我真是郁闷了
10楼2008-12-30 13:55:48
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月月大可

木虫 (著名写手)


lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论~
我曾经也用重叠PCR方法把一个启动子和一个功能基因连接在一起,在第二个片段的末尾部分也出现了你描述的这种情况,没有少30多个,少了10几个,也说不清楚原因。我的第二个片段也很长,在1.6K左右。
但是我也见过其他人用重叠PCR将8个片段连接起来的,人家的就很正常。不过8个片段都是比较短的那种,总长还不到1K。
2楼2008-12-28 08:56:24
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卡拉

新虫 (初入文坛)

我上一界的师姐  也是用重叠PCR的方法 双点突变 也是跟我做的相同基因 也是缺了那36了 这到底是为什么呢
3楼2008-12-28 22:06:03
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lliu

新虫 (小有名气)

应当不是Overlap PCR的问题。(我猜)由可能是你的序列在转入E coli里发生了同源重组后缺失。建议用RecA缺陷的E coli试试看。
4楼2008-12-29 02:06:25
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