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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请教PCR产物酶切
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sealeier

[交流] 请教PCR产物酶切

请教：PCR产物做酶切需要什么条件，产物可以直接用吗，还是要纯化，或者电泳回收，我的PCR做的是菌落PCR，条带不好，有引物二聚体，还有没扩出来的基因组DNA，还有，我做的是真菌克隆文库，目的片段在质粒里面，转到大肠杆菌里面的，是不是把质粒提出来，再做质粒PCR，然后再酶切比较好，这样做需要PCR产物纯化吗。
我的目的是对我插进质粒里的大概760BP的片段酶切分型
谢谢，希望大家多提意见
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1楼 2008-12-25 21:01:06
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charon1982

铁杆木虫 (著名写手)
★
sealeier(金币+1,VIP+0):问题解答
最好用PCR回收试剂盒回收后，条带不单一要跑胶回收，最好提质粒，这样做PCR的效率会高一点，你的PCR设计引物的时候有没有设计酶切位点啊，记得加保护碱基，……
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帮助虫友，提升自己
2楼2008-12-25 21:27:36
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gr0613

铁虫 (初入文坛)
★
sealeier(金币+1,VIP+0):解答提问
先PCR检测条带，如果条带单一，特异性好，可以直接乙醇沉淀。如果不单一，要切胶（损失较大）。试剂盒后，乙醇沉淀（加醋酸钠），注意，离心挥发乙醇后是不可见的产物（因为DNA片段太小）。然后用ddH2O或TE溶解即可使用。
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3楼2008-12-26 00:23:44
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sealeier

还想问问质粒PCR产物的条带一般怎么样，有杂带吗，可以直接酶切吗，我的目的是做ARDRA分型
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4楼2008-12-26 12:54:19
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蓝色基因

金虫 (正式写手)
★
sealeier(金币+1,VIP+0):解答问题
有没有杂带得看你具体的实验。不过我之前做微生物生态多样性的时候，做了大批量的ARDRA分型，就是直接酶切后电泳的，但前提是杂带不多。而且ARDRA实验一般比较繁琐，所以具体还是先把前处理实验做好，免得后面麻烦。
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5楼2008-12-27 10:58:20
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suguang

铜虫 (初入文坛)
★
sealeier(金币+1,VIP+0):解答问题
PCR产物做酶切是一定要做纯化的，切胶或者用纯化试剂盒。直接用菌落PCR有时候效果就是不太好，容易P不出来。出现引物二聚是一定出现的，如果出现的二聚情况比较严重的话，看引物是否有问题；另外，你酶切PCR产物的时候，产物两端要带酶切位点哦
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6楼2008-12-27 13:57:19
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j2

木虫 (正式写手)
★
sealeier(金币+1,VIP+0):解答问题
先提质粒再PCR，条带单一还是用试剂盒作了胶回收，老师说是就算是一条带也不见得就纯。然后再酶切吧。
回收试剂盒买好点，不然回收率太低就郁闷了
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修炼ｉｎｇ，当虫仙……
7楼2008-12-28 10:19:44
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bone0611

★
sealeier(金币+1,VIP+0):解答问题
先抽个质粒，然后再pcr。p出来的条带回收。但pcr产物的左右酶切位点要设计保护碱基才切的开
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8楼2008-12-28 21:45:01
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