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sealeier

[交流] 请教PCR产物酶切

请教:PCR产物做酶切需要什么条件,产物可以直接用吗,还是要纯化,或者电泳回收,我的PCR做的是菌落PCR,条带不好,有引物二聚体,还有没扩出来的基因组DNA,还有,我做的是真菌克隆文库,目的片段在质粒里面,转到大肠杆菌里面的,是不是把质粒提出来,再做质粒PCR,然后再酶切比较好,这样做需要PCR产物纯化吗。
我的目的是对我插进质粒里的大概760BP的片段酶切分型
谢谢,希望大家多提意见
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sealeier

还想问问质粒PCR产物的条带一般怎么样,有杂带吗,可以直接酶切吗,我的目的是做ARDRA分型
4楼2008-12-26 12:54:19
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charon1982

铁杆木虫 (著名写手)


sealeier(金币+1,VIP+0):问题解答
最好用PCR回收试剂盒回收后,条带不单一要跑胶回收,最好提质粒,这样做PCR的效率会高一点,你的PCR设计引物的时候有没有设计酶切位点啊,记得加保护碱基,……
帮助虫友,提升自己
2楼2008-12-25 21:27:36
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gr0613

铁虫 (初入文坛)


sealeier(金币+1,VIP+0):解答提问
先PCR检测条带,如果条带单一,特异性好,可以直接乙醇沉淀。如果不单一,要切胶(损失较大)。试剂盒后,乙醇沉淀(加醋酸钠),注意,离心挥发乙醇后是不可见的产物(因为DNA片段太小)。然后用ddH2O或TE溶解即可使用。
3楼2008-12-26 00:23:44
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蓝色基因

金虫 (正式写手)


sealeier(金币+1,VIP+0):解答问题
有没有杂带得看你具体的实验。不过我之前做微生物生态多样性的时候,做了大批量的ARDRA分型,就是直接酶切后电泳的,但前提是杂带不多。而且ARDRA实验一般比较繁琐,所以具体还是先把前处理实验做好,免得后面麻烦。
5楼2008-12-27 10:58:20
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