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19910204

新虫 (小有名气)

[求助] Fosmid 文库 构建求助 已有1人参与

最近构建了Fosmid 文库，且已经筛选了两三个月，但是一直筛不出来。因为目的片段大概10kb，我跑pcr时设计了三个不同引物，可是最后跑胶结果出来一直都是不完整的片段。请问有没有对 Fosmid 文库构建有经验的师兄师姐啊，help。。。
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1楼 2017-03-14 19:10:07
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mayunhui

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 19910204 at 2017-03-22 21:51:17
您好，谢谢回复。我的目的序列是10kb，这10kb按道理肯定包含在某个插入片段内，因为fosmid插入片段一般都在35-40kb。可是筛库的时候，能跑出来条带，但每次检测后都发现只是我这10kb的一部分，并不是完整的10kb目的 ...

筛库能跑出条带不代表这10kb的序列就刚好回全部在插入片段内，也有可能是只有一部分在里面。可以在筛出克隆后，再设计其他引物进行验证。或者也可以多筛几个克隆，可能其中的某一个就会包含全部的10kb序列。直接克隆的话，10kb序列太长，不好弄。重新建库的话是不是要考虑换方法呢？或者说至少要换内切酶，因为如果建库方法和以前一样的话，会不会仍然出现这种情况呢（能筛到，但得不到完整的）？
一般这种情况，我们是设计多对引物，然后分段筛选；最后测序拼接，得到完整的目标序列。
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书到用时方恨少
4楼2017-03-23 17:27:46
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mayunhui

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

目的片段只有10kb的话应该是连不上载体的吧。正常的fosmid文库插入片段大小都在35-40kb左右，对DNA的质量要求还是比较高的。当然我不知道你用到是哪种载体，如果你是用常用的试剂盒构建的话；我想应该会是这个原因。
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书到用时方恨少
2楼2017-03-22 10:45:19
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19910204

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by mayunhui at 2017-03-22 10:45:19
目的片段只有10kb的话应该是连不上载体的吧。正常的fosmid文库插入片段大小都在35-40kb左右，对DNA的质量要求还是比较高的。当然我不知道你用到是哪种载体，如果你是用常用的试剂盒构建的话；我想应该会是这个原因。

您好，谢谢回复。我的目的序列是10kb，这10kb按道理肯定包含在某个插入片段内，因为fosmid插入片段一般都在35-40kb。可是筛库的时候，能跑出来条带，但每次检测后都发现只是我这10kb的一部分，并不是完整的10kb目的基因序列。老板想过让直接克隆，好像直接克隆也不好弄。所以决定让重新构建文库。 您的意思是提取的gDNA的质量非常重要吧，我的载体是pEpiFOS-5。我是需要得到这个10kb的目的基因，然后做异源表达检测产物。
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3楼2017-03-22 21:51:17
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19910204

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by mayunhui at 2017-03-23 17:27:46
筛库能跑出条带不代表这10kb的序列就刚好回全部在插入片段内，也有可能是只有一部分在里面。可以在筛出克隆后，再设计其他引物进行验证。或者也可以多筛几个克隆，可能其中的某一个就会包含全部的10kb序列。直接克 ...

你好，前几天继续筛选，很幸运的筛到了我的10kb目的基因簇，接下来要异源表达。但是我不清楚具体要怎么弄，最近在看文献，感觉10kb很大，不好弄。10kb直接克隆到表达载体也不太好克隆吧，请问您有没有经验？
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5楼2017-04-19 17:34:19
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