应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » Fosmid 文库 构建求助
51/1返回列表
查看: 1514  |  回复: 4
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

19910204

新虫 (小有名气)

[求助] Fosmid 文库 构建求助 已有1人参与

最近构建了Fosmid 文库，且已经筛选了两三个月，但是一直筛不出来。因为目的片段大概10kb，我跑pcr时设计了三个不同引物，可是最后跑胶结果出来一直都是不完整的片段。请问有没有对 Fosmid 文库构建有经验的师兄师姐啊，help。。。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2017-03-14 19:10:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mayunhui

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

目的片段只有10kb的话应该是连不上载体的吧。正常的fosmid文库插入片段大小都在35-40kb左右，对DNA的质量要求还是比较高的。当然我不知道你用到是哪种载体，如果你是用常用的试剂盒构建的话；我想应该会是这个原因。
赞一下 回复此楼
书到用时方恨少
2楼2017-03-22 10:45:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

19910204

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by mayunhui at 2017-03-22 10:45:19
目的片段只有10kb的话应该是连不上载体的吧。正常的fosmid文库插入片段大小都在35-40kb左右，对DNA的质量要求还是比较高的。当然我不知道你用到是哪种载体，如果你是用常用的试剂盒构建的话；我想应该会是这个原因。

您好，谢谢回复。我的目的序列是10kb，这10kb按道理肯定包含在某个插入片段内，因为fosmid插入片段一般都在35-40kb。可是筛库的时候，能跑出来条带，但每次检测后都发现只是我这10kb的一部分，并不是完整的10kb目的基因序列。老板想过让直接克隆，好像直接克隆也不好弄。所以决定让重新构建文库。 您的意思是提取的gDNA的质量非常重要吧，我的载体是pEpiFOS-5。我是需要得到这个10kb的目的基因，然后做异源表达检测产物。
赞一下 回复此楼
3楼2017-03-22 21:51:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mayunhui

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 19910204 at 2017-03-22 21:51:17
您好，谢谢回复。我的目的序列是10kb，这10kb按道理肯定包含在某个插入片段内，因为fosmid插入片段一般都在35-40kb。可是筛库的时候，能跑出来条带，但每次检测后都发现只是我这10kb的一部分，并不是完整的10kb目的 ...

筛库能跑出条带不代表这10kb的序列就刚好回全部在插入片段内，也有可能是只有一部分在里面。可以在筛出克隆后，再设计其他引物进行验证。或者也可以多筛几个克隆，可能其中的某一个就会包含全部的10kb序列。直接克隆的话，10kb序列太长，不好弄。重新建库的话是不是要考虑换方法呢？或者说至少要换内切酶，因为如果建库方法和以前一样的话，会不会仍然出现这种情况呢（能筛到，但得不到完整的）？
一般这种情况，我们是设计多对引物，然后分段筛选；最后测序拼接，得到完整的目标序列。
赞一下 回复此楼
书到用时方恨少
4楼2017-03-23 17:27:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

19910204

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by mayunhui at 2017-03-23 17:27:46
筛库能跑出条带不代表这10kb的序列就刚好回全部在插入片段内，也有可能是只有一部分在里面。可以在筛出克隆后，再设计其他引物进行验证。或者也可以多筛几个克隆，可能其中的某一个就会包含全部的10kb序列。直接克 ...

你好，前几天继续筛选，很幸运的筛到了我的10kb目的基因簇，接下来要异源表达。但是我不清楚具体要怎么弄，最近在看文献，感觉10kb很大，不好弄。10kb直接克隆到表达载体也不太好克隆吧，请问您有没有经验？
赞一下 回复此楼
5楼2017-04-19 17:34:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 19910204 的主题更新
51/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 材料学调剂 +9 提神豆沙包 2026-02-28 11/550 2026-03-01 18:15 by ms629
[考研] 材料类求调剂 +10 wana_kiko 2026-02-28 11/550 2026-03-01 18:11 by 海嵙Y
[考研] 328求调剂 +3 aaadim 2026-03-01 5/250 2026-03-01 17:29 by njzyff
[考研] 化工专硕348，一志愿985求调剂 +5 弗格个 2026-02-28 8/400 2026-03-01 17:25 by sunny81
[考研] 0856求调剂285 +8 吕仔龙 2026-02-28 8/400 2026-03-01 17:25 by 刘兵
[考研] 290求调剂 +9 材料专硕调剂； 2026-02-28 11/550 2026-03-01 17:21 by sunny81
[考研] 0856化工专硕求调剂 +10 董boxing 2026-03-01 10/500 2026-03-01 17:19 by 刘兵
[考研] 321求调剂一志愿东北林业大学材料与化工英二数二 +4 虫虫虫虫虫7 2026-03-01 7/350 2026-03-01 16:52 by caszguilin
[考研] 0856材料求调剂 +4 麻辣鱿鱼 2026-02-28 4/200 2026-03-01 16:51 by caszguilin
[考研] 材料化工调剂 +9 今夏不夏 2026-03-01 10/500 2026-03-01 16:01 by hmn_wj
[考研] 303求调剂 +4 今夏不夏 2026-03-01 4/200 2026-03-01 14:46 by 嘟嘟小浣熊
[考研] 295复试调剂 +3 简木ChuFront 2026-03-01 3/150 2026-03-01 14:27 by zzxw520th
[考研] 272求调剂 +5 材紫有化 2026-02-28 5/250 2026-03-01 11:51 by gaoxiaoniuma
[考研] 寻找调剂 +4 LYidhsjabdj 2026-02-28 4/200 2026-03-01 10:56 by sunny81
[考博] 博士自荐 +4 kkluvs 2026-02-28 4/200 2026-03-01 10:19 by 馥安馥安
[硕博家园] 博士自荐 +6 科研狗111 2026-02-26 10/500 2026-03-01 10:02 by 科研狗111
[论文投稿] Optics letters投稿被拒求助 30+3 luckyry 2026-02-26 4/200 2026-03-01 09:06 by babero
[考研] 材料调剂 +4 爱擦汗的可乐冰 2026-02-28 4/200 2026-03-01 00:38 by 猫猫球alter
[考研] 304求调剂 +3 52hz~~ 2026-02-28 5/250 2026-03-01 00:00 by 52hz~~
[高分子] 求环氧树脂研发1名 +3 孙xc 2026-02-25 11/550 2026-02-28 16:57 by ichall
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭