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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » red同源重组PCP20质粒转化问题
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w789xd

新虫 (初入文坛)

[求助] red同源重组PCP20质粒转化问题 已有2人参与

最近在做red重组，已经用氯霉素抗性基因替换了敲除基因，用PCP20质粒做电转，37度培养1h，划氨苄平板30度，取单菌落转接划到另一个氨苄平板30度，然后取单菌落接LB培养基42度培养，在无抗平板上划单菌落，取单菌落影印到氯霉素，氨苄霉素，无抗平板上，但结果所有的平板都长了菌，求各位大神帮忙找找原因，谢谢，很急！！

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1楼 2017-03-13 11:25:18
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小冀-

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
验证一下感受态细胞吧，看看是不是感受态染菌了
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···
2楼2017-03-13 12:21:19
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w789xd

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小冀- at 2017-03-13 12:21:19
验证一下感受态细胞吧，看看是不是感受态染菌了

谢谢您的回复，我做了三批感受态做了四次都是这样的结果，染了杂菌都有氨苄抗性和氯霉抗性的可能性也不是很高。

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3楼2017-03-13 20:19:53
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小冀-

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引用回帖:
3楼: Originally posted by w789xd at 2017-03-13 20:19:53
谢谢您的回复，我做了三批感受态做了四次都是这样的结果，染了杂菌都有氨苄抗性和氯霉抗性的可能性也不是很高。
...

好吧，你确认一下抗生素有没有失效，如果没有的话还真不知道是哪里的问题
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w789xd
···
4楼2017-03-13 20:57:11
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碾压

新虫 (初入文坛)
楼主我也遇到过同样的问题，后来发现确实是感受态的问题，建议楼主确认一次重组菌是否还是你的那个菌

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w789xd
5楼2017-03-14 11:18:36
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w789xd

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小冀- at 2017-03-13 20:57:11
好吧，你确认一下抗生素有没有失效，如果没有的话还真不知道是哪里的问题...

谢谢您～

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6楼2017-03-14 12:19:08
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w789xd

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by 碾压 at 2017-03-14 11:18:36
楼主我也遇到过同样的问题，后来发现确实是感受态的问题，建议楼主确认一次重组菌是否还是你的那个菌

谢谢您，感受态做过三次，那我再做一次？

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7楼2017-03-14 12:19:33
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碾压

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
7楼: Originally posted by w789xd at 2017-03-14 12:19:33
谢谢您，感受态做过三次，那我再做一次？
...

我之前和你的情况一样，在两种抗性平板上都长，并且我拉了pcr进行验证，始终都得不到我要的条带，后来我把做感受态的一次重组菌验证了一下，发现并不是我原本的菌，建议你确定每一步都没问题后再往下做，不然浪费很长时间

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8楼2017-03-14 14:16:54
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日落沙发

新虫 (小有名气)
pcp20不是温感型质粒吗，37℃培养一小时应该amp抗性应该消失了啊

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9楼2017-09-12 09:42:08
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