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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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ssitxtgm

新虫 (小有名气)

[求助] 重组表达 已有1人参与

各位虫友，本人最近在做原核表达，用PET-28a，用了Nco I 和 bamHI  做双酶切，导入一段完整的171bp的ORF。图谱如下
由于存在完整的启动子和终止子，那么是否就是无法连接使用his-tag标签，如果是这样我在这段基因末端去掉终止子，使其连接后续28a基因连接上his-tag标签，是否会改变需要表达的这段蛋白。
由于需要表达的蛋白在6KD左右的小分子肽存在毒性，应该是包涵体形式存在，那么如何纯化已经表达的包涵体呢？请教下大家。

@biostar2009 @飞约疯人院 @wizardfan @youlinglyw 发自小木虫IOS客户端
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1楼 2017-03-08 15:05:32
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2017-03-13 07:45:23
你说的应该是起始密码子和终止密码子吧，去掉密码子是可以和his标签融合表达的，一般不会改变蛋白的活性，现在有些酶可以切除蛋白标签的。关于你这么小的肽链如何纯化可以先按his标签的纯化方法试一下，但是有毒性的多肽，不知道菌体生长有没有影响，也不确定是否在包涵体内，毕竟是外源的基因表达。

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
2楼2017-03-08 18:57:12
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ssitxtgm

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 原海亮 at 2017-03-08 18:57:12
你说的应该是起始密码子和终止密码子吧，去掉密码子是可以和his标签融合表达的，一般不会改变蛋白的活性，现在有些酶可以切除蛋白标签的。关于你这么小的肽链如何纯化可以先按his标签的纯化方法试一下，但是有毒性的 ...

只是去掉终止密码子，使连接his标，我现在就是会怕影响表达，毕竟没做过，一做的话时间又得挺久。

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3楼2017-03-09 21:59:57
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辉102526

新虫 (初入文坛)
6kD的蛋白有点小，但还可以做，形成包涵体，那就复性了

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4楼2017-03-13 00:37:43
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ssitxtgm

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 辉102526 at 2017-03-13 00:37:43
6kD的蛋白有点小，但还可以做，形成包涵体，那就复性了

意思是就按照我现行酶切位点不连接histag标签，然后使用盐酸胍或者尿素对包含体进行复兴提取嘛？

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5楼2017-03-13 10:45:29
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