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最-难忘

木虫 (正式写手)

[求助] 载体 和目的片段overlap pcr 总是连不上 求助 已有2人参与

目的片段是3.6k,载体是6k。
目的片段是用overlap方法连接5个片段成功了
载体是用反向pcr和酶切线性化的
然后用overlap方法构建新载体老是出现图中的条带?
试过几次。都是这种情况,条带在点样孔附近。不知道咋办了,求各位大神帮帮忙

载体 和目的片段overlap pcr  总是连不上   求助


载体 和目的片段overlap pcr  总是连不上   求助-1


@biostar2009 发自小木虫Android客户端
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-03-03 21:06:02
第一,你的胶放反了,第二就是在加样孔里的极有可能是蛋白或基因组,提取的时候有问题,第三你是跑的质粒吗,如果是的话可能是没连上,第四,载体为什么要反向pcr,不能直接酶切做overlap吗
···
2楼2017-02-28 08:35:39
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最-难忘

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 小冀- at 2017-02-28 08:35:39
第一,你的胶放反了,第二就是在加样孔里的极有可能是蛋白或基因组,提取的时候有问题,第三你是跑的质粒吗,如果是的话可能是没连上,第四,载体为什么要反向pcr,不能直接酶切做overlap吗

酶切也试过 得到的结果是一样的。胶的确是放反了的 习惯这样子了。但是单独酶切质粒跑出来也是一样的

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3楼2017-02-28 08:51:44
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

引用回帖:
3楼: Originally posted by 最-难忘 at 2017-02-28 08:51:44
酶切也试过 得到的结果是一样的。胶的确是放反了的 习惯这样子了。但是单独酶切质粒跑出来也是一样的
...

你跑的胶跑的是啥,pcr的还是质粒?

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···
4楼2017-02-28 09:24:33
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最-难忘

木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 小冀- at 2017-02-28 09:24:33
你跑的胶跑的是啥,pcr的还是质粒?
...

pcr和质粒跑了 然后回收 做overlap

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5楼2017-02-28 09:37:12
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六维空想

新虫 (小有名气)

请问你的overlap pcr的条件是什么  重叠片段大概多少

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6楼2017-02-28 21:25:00
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最-难忘

木虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 六维空想 at 2017-02-28 21:25:00
请问你的overlap pcr的条件是什么  重叠片段大概多少

条件就是普通pcr 10x 然后再加引物 继续30x
重叠片段将近10k

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7楼2017-02-28 22:07:05
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zhangnan163

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-03-03 21:06:30
最近在做,没有且胶回收,pcr后,跑4ul,看看是否特异  直接pcr产物回收,然后overlap  模板量加多一点  大于100ng  1:1  直接pcr
8楼2017-03-03 17:18:09
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草溪河

铁虫 (著名写手)

用平末端的高保真酶分别扩出目的片段和载体,目的片段磷酸化处理,载体去磷酸化,然后二者直接平末端连接。

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9楼2017-03-03 22:00:31
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