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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 载体 和目的片段overlap pcr 总是连不上 求助
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最-难忘

木虫 (正式写手)

[求助] 载体 和目的片段overlap pcr 总是连不上 求助 已有2人参与

目的片段是3.6k，载体是6k。
目的片段是用overlap方法连接5个片段成功了
载体是用反向pcr和酶切线性化的
然后用overlap方法构建新载体老是出现图中的条带?
试过几次。都是这种情况，条带在点样孔附近。不知道咋办了，求各位大神帮帮忙

载体 和目的片段overlap pcr  总是连不上   求助


载体 和目的片段overlap pcr  总是连不上   求助-1


@biostar2009 发自小木虫Android客户端
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1楼 2017-02-28 00:14:52
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-03-03 21:06:02
第一，你的胶放反了，第二就是在加样孔里的极有可能是蛋白或基因组，提取的时候有问题，第三你是跑的质粒吗，如果是的话可能是没连上，第四，载体为什么要反向pcr，不能直接酶切做overlap吗
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···
2楼2017-02-28 08:35:39
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最-难忘

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小冀- at 2017-02-28 08:35:39
第一，你的胶放反了，第二就是在加样孔里的极有可能是蛋白或基因组，提取的时候有问题，第三你是跑的质粒吗，如果是的话可能是没连上，第四，载体为什么要反向pcr，不能直接酶切做overlap吗

酶切也试过 得到的结果是一样的。胶的确是放反了的 习惯这样子了。但是单独酶切质粒跑出来也是一样的

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3楼2017-02-28 08:51:44
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
引用回帖:
3楼: Originally posted by 最-难忘 at 2017-02-28 08:51:44
酶切也试过 得到的结果是一样的。胶的确是放反了的 习惯这样子了。但是单独酶切质粒跑出来也是一样的
...

你跑的胶跑的是啥，pcr的还是质粒？

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···
4楼2017-02-28 09:24:33
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最-难忘

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小冀- at 2017-02-28 09:24:33
你跑的胶跑的是啥，pcr的还是质粒？
...

pcr和质粒跑了 然后回收 做overlap

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5楼2017-02-28 09:37:12
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六维空想

新虫 (小有名气)
请问你的overlap pcr的条件是什么  重叠片段大概多少

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6楼2017-02-28 21:25:00
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最-难忘

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 六维空想 at 2017-02-28 21:25:00
请问你的overlap pcr的条件是什么  重叠片段大概多少

条件就是普通pcr 10x 然后再加引物 继续30x
重叠片段将近10k

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7楼2017-02-28 22:07:05
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zhangnan163

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-03-03 21:06:30
最近在做，没有且胶回收，pcr后，跑4ul，看看是否特异  直接pcr产物回收，然后overlap  模板量加多一点  大于100ng  1:1  直接pcr
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8楼2017-03-03 17:18:09
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草溪河

铁虫 (著名写手)
用平末端的高保真酶分别扩出目的片段和载体，目的片段磷酸化处理，载体去磷酸化，然后二者直接平末端连接。

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9楼2017-03-03 22:00:31
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