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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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小猫三两只

金虫 (正式写手)

[交流] 求助 连接的问题

各位大侠,最近做连接时,基因与载体老是连不上,是怎么回事,连接酶也换了好几种,还是不行,转化到大肠杆菌后,提到的质粒都是空载体,或者条带不对!!
     有老师说是连接前的双酶切效率低的问题,可怎样提高酶切效率啊?而且酶切后检测的片段都是正确的,回收时就只有一条目的带,以前做实验也没遇到过这种问题.
     另外,我曾试着将载体连到T载体上,这样连接切后再连的效率就比较高了,但听说连到T载体上会使基因发生移码突变,表达的蛋白活性低甚至没有活性,不知是否对.现在我也不敢往T载体上连了
     请问各位大侠,有何高招,谢谢了!!
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小猫三两只

金虫 (正式写手)

非常感谢虫友的帮助,我想再问一下,当连接比较困难时,有没有改进的一些方法可以提高连接效率,我指的是不同于平时的做法。
昨天连接后提的质粒酶切后观察,好像基因连上了,因为有那个基因的带,但是再有该重组质粒为模板PCR扩增基因时,又没有基因的带了,但是同时做的阳性对照是有带的。
4楼2008-12-22 11:43:44
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lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人

★ ★
小猫三两只(金币+2,VIP+0):谢谢了,可是测序结果也会有不准确的啊
连接完测个序 突变不突变就知道了
细推物理须行乐。
2楼2008-12-21 18:30:32
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csx2044

至尊木虫 (正式写手)

★ ★ ★
小猫三两只(金币+3,VIP+0):非常感谢
建议:连接后先进行DNA测序,看测序结果后才能判定,祝好运。我做这部分实验的时候就比较lucky,一周内就得到克隆了。不要着急,心态平稳才会有好的结果。
我为虫虫,虫虫为我
3楼2008-12-21 22:29:40
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suguang

铜虫 (初入文坛)

★ ★ ★
小猫三两只(金币+3,VIP+0):去磷酸化也做过,效果也不是太好
1、增大连接载体和目的基因的浓度和反应体积、时间,适当加大酶量
2、适当增大目的基因与载体的摩尔比例
3、载体酶切后去磷处理
5楼2008-12-22 15:19:56
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