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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助 连接的问题
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小猫三两只

金虫 (正式写手)

[交流] 求助 连接的问题

各位大侠,最近做连接时,基因与载体老是连不上,是怎么回事,连接酶也换了好几种,还是不行,转化到大肠杆菌后,提到的质粒都是空载体,或者条带不对!!
     有老师说是连接前的双酶切效率低的问题,可怎样提高酶切效率啊?而且酶切后检测的片段都是正确的,回收时就只有一条目的带,以前做实验也没遇到过这种问题.
     另外,我曾试着将载体连到T载体上,这样连接切后再连的效率就比较高了,但听说连到T载体上会使基因发生移码突变,表达的蛋白活性低甚至没有活性,不知是否对.现在我也不敢往T载体上连了
     请问各位大侠,有何高招,谢谢了!!
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1楼 2008-12-21 13:54:54
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lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人
★ ★
小猫三两只(金币+2,VIP+0):谢谢了，可是测序结果也会有不准确的啊
连接完测个序 突变不突变就知道了
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细推物理须行乐。
2楼2008-12-21 18:30:32
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csx2044

至尊木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小猫三两只(金币+3,VIP+0):非常感谢
建议：连接后先进行DNA测序，看测序结果后才能判定，祝好运。我做这部分实验的时候就比较lucky，一周内就得到克隆了。不要着急，心态平稳才会有好的结果。
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我为虫虫，虫虫为我
3楼2008-12-21 22:29:40
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
非常感谢虫友的帮助，我想再问一下，当连接比较困难时，有没有改进的一些方法可以提高连接效率，我指的是不同于平时的做法。
昨天连接后提的质粒酶切后观察，好像基因连上了，因为有那个基因的带，但是再有该重组质粒为模板PCR扩增基因时，又没有基因的带了，但是同时做的阳性对照是有带的。
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4楼2008-12-22 11:43:44
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suguang

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小猫三两只(金币+3,VIP+0):去磷酸化也做过,效果也不是太好
1、增大连接载体和目的基因的浓度和反应体积、时间，适当加大酶量
2、适当增大目的基因与载体的摩尔比例
3、载体酶切后去磷处理
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5楼2008-12-22 15:19:56
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xychern

★
lixiaoyi1981(金币+1,VIP+0):这个值得一试
酶切产物纯化回收以后跑了电泳没,如果能看到条带,足够做连接了

PCR产物:载体=10:1,按照这个量加,连接体系也不要太大,20-25ul
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6楼2008-12-23 21:05:18
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addict1234

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
小猫三两只(金币+3,VIP+0):这个方法听起来不错,能不能介绍详细点
建议你不要把用于连接的目的条带进行染色，而是将一部分酶切产物经行染色，然后再比对着染色的目的条带切胶回收没有染色的目的条带，这样连接效率会大幅度提高。
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7楼2008-12-24 14:10:00
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
★ ★ ★ ★
小猫三两只(金币+2,VIP+0):这个酶是怎么用的,和一般的连接酶一样吗?
小猫三两只(金币+2,VIP+0):这个酶是怎么用的,和一般的连接酶一样吗?
用浓缩型的连接酶(我们一般建库时才用这个)
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8楼2008-12-24 15:29:53
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
和一般的连接酶一样用
但价格稍贵
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9楼2008-12-25 16:11:55
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addict1234

铜虫 (小有名气)
用少量的酶切溶液点一个孔，再将剩下的酶切液点在另一个孔里，电泳后用刀片切去少量酶切液的泳道经行染色，然后在紫外下和没有染色的凝胶拼对整齐了，再在较多酶切液的泳道的相应位置用刀片切取含目的条带的凝胶，然后从切下来的凝胶中回收目的片段。EB染料对连接有影响，特别是EB浓度较高时，影响很大。
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10楼2008-12-25 17:04:42
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