应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助 连接的问题
101/1返回列表
查看: 687  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。

小猫三两只

金虫 (正式写手)

[交流] 求助 连接的问题

各位大侠,最近做连接时,基因与载体老是连不上,是怎么回事,连接酶也换了好几种,还是不行,转化到大肠杆菌后,提到的质粒都是空载体,或者条带不对!!
     有老师说是连接前的双酶切效率低的问题,可怎样提高酶切效率啊?而且酶切后检测的片段都是正确的,回收时就只有一条目的带,以前做实验也没遇到过这种问题.
     另外,我曾试着将载体连到T载体上,这样连接切后再连的效率就比较高了,但听说连到T载体上会使基因发生移码突变,表达的蛋白活性低甚至没有活性,不知是否对.现在我也不敢往T载体上连了
     请问各位大侠,有何高招,谢谢了!!
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2008-12-21 13:54:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lauren180

木虫 (著名写手)

小木虫挖井人
★ ★
小猫三两只(金币+2,VIP+0):谢谢了，可是测序结果也会有不准确的啊
连接完测个序 突变不突变就知道了
赞一下(4人) 回复此楼
细推物理须行乐。
2楼2008-12-21 18:30:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

csx2044

至尊木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小猫三两只(金币+3,VIP+0):非常感谢
建议：连接后先进行DNA测序，看测序结果后才能判定，祝好运。我做这部分实验的时候就比较lucky，一周内就得到克隆了。不要着急，心态平稳才会有好的结果。
赞一下(4人) 回复此楼
我为虫虫，虫虫为我
3楼2008-12-21 22:29:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小猫三两只

金虫 (正式写手)
非常感谢虫友的帮助，我想再问一下，当连接比较困难时，有没有改进的一些方法可以提高连接效率，我指的是不同于平时的做法。
昨天连接后提的质粒酶切后观察，好像基因连上了，因为有那个基因的带，但是再有该重组质粒为模板PCR扩增基因时，又没有基因的带了，但是同时做的阳性对照是有带的。
赞一下 回复此楼
4楼2008-12-22 11:43:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

suguang

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小猫三两只(金币+3,VIP+0):去磷酸化也做过,效果也不是太好
1、增大连接载体和目的基因的浓度和反应体积、时间，适当加大酶量
2、适当增大目的基因与载体的摩尔比例
3、载体酶切后去磷处理
赞一下(3人) 回复此楼
5楼2008-12-22 15:19:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xychern

★
lixiaoyi1981(金币+1,VIP+0):这个值得一试
酶切产物纯化回收以后跑了电泳没,如果能看到条带,足够做连接了

PCR产物:载体=10:1,按照这个量加,连接体系也不要太大,20-25ul
赞一下(10人) 回复此楼
6楼2008-12-23 21:05:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

addict1234

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
小猫三两只(金币+3,VIP+0):这个方法听起来不错,能不能介绍详细点
建议你不要把用于连接的目的条带进行染色，而是将一部分酶切产物经行染色，然后再比对着染色的目的条带切胶回收没有染色的目的条带，这样连接效率会大幅度提高。
赞一下(2人) 回复此楼
7楼2008-12-24 14:10:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaocy8903

木虫 (知名作家)
★ ★ ★ ★
小猫三两只(金币+2,VIP+0):这个酶是怎么用的,和一般的连接酶一样吗?
小猫三两只(金币+2,VIP+0):这个酶是怎么用的,和一般的连接酶一样吗?
用浓缩型的连接酶(我们一般建库时才用这个)
赞一下(3人) 回复此楼
8楼2008-12-24 15:29:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaocy8903

木虫 (知名作家)
和一般的连接酶一样用
但价格稍贵
赞一下 回复此楼
9楼2008-12-25 16:11:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

addict1234

铜虫 (小有名气)
用少量的酶切溶液点一个孔，再将剩下的酶切液点在另一个孔里，电泳后用刀片切去少量酶切液的泳道经行染色，然后在紫外下和没有染色的凝胶拼对整齐了，再在较多酶切液的泳道的相应位置用刀片切取含目的条带的凝胶，然后从切下来的凝胶中回收目的片段。EB染料对连接有影响，特别是EB浓度较高时，影响很大。
赞一下 回复此楼
10楼2008-12-25 17:04:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 小猫三两只 的主题更新
101/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 什么时候开奖？ +6 CrisMessi 2026-08-18 6/300 2026-08-19 08:06 by Equinoxhua
[基金申请] 朋友圈看到的 +5 wangzilk 2026-08-18 6/300 2026-08-19 08:05 by luw152
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +52 医学老男孩 2026-08-13 113/5650 2026-08-19 07:58 by 医学老男孩
[基金申请] 结合人工智能，周易传统文化，filecode打分制来了，3分以上希望很大。 +4 Tide man 2026-08-12 5/250 2026-08-19 07:41 by 201120518022
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +10 yuleib84 2026-08-18 11/550 2026-08-19 07:30 by 羽毛枫f
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +7 启萌科技 2026-08-12 27/1350 2026-08-18 21:44 by Noways
[教师之家] 为什么余额宝的年化利率越来越低？主要原因有哪些？ +3 瞬息宇宙 2026-08-15 3/150 2026-08-18 21:40 by xiaohuixin
[基金申请] 明天放榜？ +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +8 基诺咪客 2026-08-17 11/550 2026-08-18 17:13 by 悠然熊猫
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +14 archvillain 2026-08-15 26/1300 2026-08-18 13:37 by phantomgost
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？ +13 Ldrop2023 2026-08-13 16/800 2026-08-18 12:25 by 淀粉搬运工
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +4 且听虎啸 2026-08-17 5/250 2026-08-18 00:49 by 蔡棒棒菂
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +6 angus9576 2026-08-17 11/550 2026-08-17 23:57 by angus9576
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +8 wangze12014 2026-08-14 10/500 2026-08-17 17:05 by xter9665
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +8 zju2000 2026-08-16 9/450 2026-08-17 12:20 by lmz0216
[精细化工] 招聘 金属平磨液，抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
[基金申请] 重要来源：本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] Filecode 又变了，巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭