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请问在用cfDNA构建二代测序文库的时候用磁珠去除大片段的原理是什么？ 已有3人参与
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请问在用cfDNA构建二代测序文库的时候有个去大片段的步骤，用磁珠去除大片段的原理是什么？ 实验步骤如下： 1 DNA 片段末端补平 * 将末端补平试剂置于冰盒上溶解；（注意：Mix反应混合液配制应在冰盒上进行！）试剂应该提前从冰箱拿出，在冰盒上溶解！ * 配制Mix 1：准备一个1.5ml EP管，标号为Mix 1，在冰盒上根据样品数配制，每个样本应多配10%； * Components 1RXN (uL) 24RXN (uL) 48RXN (uL) Remarks * 10×Buffer2.1 5.0 132.0 264.0 * dNTP 0.50 13.20 26.40 * T4 Polymerase 0.20 5.28 10.56 * PNK 1.00 26.40 52.80 * Total 6.70 176.88 353.76 * 用单枪把配制好的Mix 1混合液按照上表分装到8连排PCR管中； * 用EP-10排枪吸取Mix 1混合液6.7μl到装有43μl DNA样品孔中，用同一枪头吹打润洗残留在枪头壁上的Mix混合液，轻微震荡混匀后离心数秒（注：吹打时尽量避免产生气泡，最后一枪可缓慢打下，若有气泡产生可进行轻微离心消除）； * 将96孔反应板置于pcr仪上反应，反应程序：25℃,30min；75℃，10min；4℃，hold；（距反应结束还有10min时，可预先准备Barcode和配制mix2） * 反应结束后，取出96孔板轻微震荡离心； 2 去除大片段： * 用EP-100排枪加入MV Beads40ul（1：0.8）,吹打混匀20次左右，室温（20 -25℃）5分钟； * 将96孔板插入96孔磁铁板（DynaMag-96 Side)， 待溶液变澄清之后，用EP-300排枪将上清液(~89uL)全部转移到同一96孔板的下一排孔中。 * 末端修复后纯化； * 移除磁铁板，紧接用EP-100 排枪加入107μl（1：1.2） MV Beads; 吹打20次左右混匀；室温（20 -25℃）5分钟； * 将96孔板插入96孔磁铁板，待磁珠吸附完全溶液变澄清之后（约15分钟左右）； （ ） 3 DNA片段末端连接反应 * 配制Mix 2：标记1.5ml EP管为Mix 2， 在冰盒上根据样品数配制，每个样本多配10% ；（注意：Mix反应混合液配制应在冰盒上进行！试剂提前冰箱拿出，冰盒上溶解！） * Components 1RXN (uL) 24RXN (uL) 48RXN (uL) Remarks * H2O 0 0.0 0.0 * 5×Ligation Buffer 8 211.2 422.4 * P1 Adapter（1：10） 1 26.4 52.8 * DNA ligase 2 52.8 105.6 * Total 11.00 290.40 580.80 * 待溶液变澄清，将吸去上清液（丢弃），注意不要吸到磁珠（可分次吸去）。 * 当天配制的80%乙醇倒适量到移液槽中；用EP-300移液枪缓慢吸取200μl到 96孔板中；移动96孔板在磁铁中位置（来回一次，让磁珠得到充分洗脱）。 * 重复80%的乙醇洗脱一次。注：未用完80%乙醇放回管中（不能在移液槽中暴露挥发）。 * 吸去上清液溶液后，96孔板快速离心，尽量吸去上清液溶液后，室温晾干 8分钟； （ ） * 用ep-100 排枪加 28μl low TE到96-孔板样品孔中；吹打混匀；室温（20 -25℃）5分钟； * 放回磁铁板，液体澄清后，用EP-100排枪转移上清28uL到96孔板的下一排； * 吸取11 ul Mix 2到洗脱的28 uL样品管中； * 用单枪吸取 1 uL barcode（已稀释好的） 到相应样品管中；（注意：开4~6个barcod管盖需要换一次手套，避免交叉污染！） * 将96孔反应板贴上盖膜，震荡混匀后轻微离心数秒后，将96孔反应板置于pcr仪上反应；反应程序：25℃,1h；70℃，5min；4℃，hold；（注：混匀时尽量不要产生气泡，若有气泡产生可进行瞬时离心消除） |
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2楼2017-03-14 17:21:48
3楼2017-08-08 09:18:22
大大女超人
新虫 (初入文坛)
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【答案】应助回帖
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4楼2022-04-22 11:31:35
