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酶切、连接、转化求助
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我计划用双酶切我的PCR产物，和pGL3质粒，然后转化大肠杆菌JM109.如果顺利，转染重组质粒进入HepG2细胞。我有如下问题请教大家： （1）PCR之后、酶切之前，是否要胶回收、或者清洗PCR产物？ （2）酶切的时候，要加多少单位的酶？我准备用50ul体系。 （3）两种酶可以用同一种buffer。我可否将两种酶同时加入？ （4）T4连接的时候，要加多少单位的酶？ （5）连接之后，是否要提纯质粒，然后转化？ （6）转染HepG2细胞，那种kit比较合适？ （7）转染一般多少次重复？ （8）转染细胞应该在单个的10cm的plate里培养，还是6-well 里面培养？是不是6-well的plate会好点、更均一一些？ (9) HepG2等贴壁细胞，分瓶之前培养基是否要37°预热？ Thanks！ [ Last edited by forget1997 on 2008-12-18 at 14:07 ] |
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amisking(金币+3,VIP+0):欢迎发帖交流！ 6-1 12:01
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双酶切你去查公用buffer 在公用buffer里活性都不错的话就一起加进去，不要做2个单酶切了，回收2次损失很大。 HepG2细胞贴壁不是很容易消化下来，通常我0.1%Trip需要用2min来消化 所以你开始传细胞的时候就把培养液拿出来放在酒精灯附近就行了 消化细胞不建议放到培养箱里去，很容易过头，而且效果不那么好，不缺那一点时间，而且从超净台拿到培养箱还增加污染的机会。 可以不预热，因为肿瘤细胞比较皮实，我们在不转染只是维持细胞的情况下都是不预热的，但是要转染之前几天会好好调整一次细胞状态 另外 建议用6well板 比较好种匀 |
14楼2009-06-01 10:16:45
2楼2008-12-18 14:13:21
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lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢参与讨论~
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（1）PCR之后、酶切之前，是否要胶回收、或者清洗PCR产物？ 要 （2）酶切的时候，要加多少单位的酶？我准备用50ul体系。 按酶的活性单位和你酶切产物的量，适当加大用量或酶切时间 （3）两种酶可以用同一种buffer。我可否将两种酶同时加入？ 参考酶公司提供的目录上的双酶切使用Buffer列表 （4）T4连接的时候，要加多少单位的酶？ 按各个酶的说明书，可适当加大酶量和连接时间 （5）连接之后，是否要提纯质粒，然后转化？ 一般不需要纯化，连接产物直接可以转化，也可以醇沉后转化 |
3楼2008-12-18 14:17:13
bbyu007
木虫 (正式写手)
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我们做的过程前面差不多，只能回答你前4步，仅供参考： （1）PCR之后、酶切之前 这之间要有不少工作要做。首先，回收pcr产物，然后将其连T载体。因为只有从T载体切下来的目的片段才有粘性末端，才能继续下一步的连接等工作。其次，蓝白斑选择，挑小的白斑，摇菌，做菌落pcr，挑正确的菌落后，提去质粒DNA，做酶切跑胶验证，验证正确后，送测序，测序正确后可以酶切，连接了。 （2）酶切用50 ul可以。2种酶均加1.5 ul即可。 （3）加0.5 ul。 （4）不用提纯，直接转化。 以下请高手继续解答。 |
4楼2008-12-18 14:22:49