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qwky2010

金虫 (著名写手)

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[交流] 恳切希望帮帮分析电泳图，诚心谢谢

大家好，我现在用连接有目的片段的pGM-T质粒载体为模板做PCR，由于没有什么经验，PCR的条件还在摸索，我的目的片段是1290bp,我一直都是用25微升的反应体系：
【dNTP（10mM的）    0.5微升，
模板                         0.5微升，
正反引物                   各0.5微升，
rTaq                         0.2微升，
10*buffer                2.5微升，
ddH2O                   20.3微升，】
PCR反应条件是：
【1、95度 5分钟，
2、94度 50秒，
3、60度 45秒
4、72度 2分钟
5、72度  10分钟
6、16度 2分钟】
我的引物序列（加了酶切位点引物设计应该没有问题）：
forward, 5-CCGGAATTCATGACGAGCTACAGTTTATTTTGGATGTC-3
Reverse, 5-CGCGGATCCCTACCAACCAATATTGGTTGCTTCAG-3
合成的引物单上给出的上游Tm：66.74度，下游是69.3度，我用TAE，0.8%的胶跑了30分钟，EB染色30分钟结果显示是如下图：

我不知道为什么出现那多的非特性条带。
电泳图说明：泳道2，3，6，7，8，9，（所用的质粒模板为试剂盒提取且没有加水稀释，《当时质粒提取时是2毫升的菌液，提取后用80微升的水洗脱》，据说用质粒做模板pcr时要将其稀释）。
泳道4，5（所用的质粒模板为试剂盒提取且加水稀释了20倍）
另外电泳图的后两个泳道是我连接有目的片段的pGM-T质粒载体做的酶切结果（质粒的提取质量很好），不知道为什么总是出现涂抹带状，我想得到的是3kb和1.29kb两个片段，但结果成了这个样子，我用的酶切体系是：
EcoRⅠ buffer 2微升
质粒                8微升
ddH2O          9.5微升
EcoRⅠ          0.5微升
37度水浴6个小时后直接电泳，据说可以不用灭酶活（65度20分钟），所有没做。之前我做过4小时水浴后直接做了电泳。15小时水浴后电泳但结果是此图中的涂抹带状，效果很差不好，自己才疏学浅，请求大家以自己博学的知识指导我，真诚的感激您，谢谢！
如果这里看不到图片请到我的小木虫空间的相册看看，谢谢你

[ Last edited by qwky2010 on 2008-12-17 at 21:14 ]

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