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恳切希望帮帮分析电泳图，诚心谢谢
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大家好，我现在用连接有目的片段的pGM-T质粒载体为模板做PCR，由于没有什么经验，PCR的条件还在摸索，我的目的片段是1290bp,我一直都是用25微升的反应体系： 【dNTP（10mM的） 0.5微升， 模板 0.5微升， 正反引物 各0.5微升， rTaq 0.2微升， 10*buffer 2.5微升， ddH2O 20.3微升，】 PCR反应条件是： 【1、95度 5分钟， 2、94度 50秒， 3、60度 45秒 4、72度 2分钟 5、72度 10分钟 6、16度 2分钟】 我的引物序列（加了酶切位点引物设计应该没有问题）： forward, 5-CCGGAATTCATGACGAGCTACAGTTTATTTTGGATGTC-3 Reverse, 5-CGCGGATCCCTACCAACCAATATTGGTTGCTTCAG-3 合成的引物单上给出的上游Tm：66.74度，下游是69.3度，我用TAE，0.8%的胶跑了30分钟，EB染色30分钟结果显示是如下图： 我不知道为什么出现那多的非特性条带。 电泳图说明：泳道2，3，6，7，8，9，（所用的质粒模板为试剂盒提取且没有加水稀释，《当时质粒提取时是2毫升的菌液，提取后用80微升的水洗脱》，据说用质粒做模板pcr时要将其稀释）。 泳道4，5（所用的质粒模板为试剂盒提取且加水稀释了20倍） 另外电泳图的后两个泳道是我连接有目的片段的pGM-T质粒载体做的酶切结果（质粒的提取质量很好），不知道为什么总是出现涂抹带状，我想得到的是3kb和1.29kb两个片段，但结果成了这个样子，我用的酶切体系是： EcoRⅠ buffer 2微升 质粒 8微升 ddH2O 9.5微升 EcoRⅠ 0.5微升 37度水浴6个小时后直接电泳，据说可以不用灭酶活（65度20分钟），所有没做。之前我做过4小时水浴后直接做了电泳。15小时水浴后电泳但结果是此图中的涂抹带状，效果很差不好，自己才疏学浅，请求大家以自己博学的知识指导我，真诚的感激您，谢谢！ 如果这里看不到图片请到我的小木虫空间的相册看看，谢谢你 [ Last edited by qwky2010 on 2008-12-17 at 21:14 ] |
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