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观享世界

木虫 (小有名气)

[求助] 比较着急的问题,关于基因敲除的,请大神解答 已有3人参与

附件是载体图谱,图谱中仅有两个酶切位点,分别是EcoRI和AgeI,我就是用双酶切后然后在这两个位点间插入shRNA,之后就是常规的步骤涂板挑单克隆啥的,最后做出来测序也没问题。
但是到病毒包装感染细胞后筛选就出问题了:图谱中可以看到,该载体含有puro抗性序列,我用puro筛选感染后的细胞,细胞无法存活,重复了很多遍,也让不同的人重复这一步,结果都一样。
请问大神们,到底哪里出问题了?

比较着急的问题,关于基因敲除的,请大神解答
图片1.png@biostar2009@飞约疯人院@wizardfan@youlinglyw
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书写人生
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2017-02-01 22:36:40
莫非没有感染成功?感染效率怎么样啊。
2楼2017-02-01 16:10:43
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3楼2017-02-01 16:22:45
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2017-02-01 22:36:53
听起来是病毒包装不成功。。。
4楼2017-02-01 21:09:11
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5楼2017-02-01 21:39:07
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观享世界

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2017-02-01 16:10:43
莫非没有感染成功?感染效率怎么样啊。

这个我也考虑过,重复了好几次包装,也不行,也把这个质粒交给其他实验室的做,结果也是一样的

发自小木虫Android客户端
书写人生
6楼2017-02-02 04:27:36
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magicbard

铁杆木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

puro是不是要Tet-on才表达。。。只用过pLKO.1没用过这个tet-on系统的
7楼2017-03-22 03:17:41
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