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生物药学

新虫 (小有名气)

[交流] 菌液pcr

现在挑取单菌落，20ul体系，出现模糊的条带，引物二聚体很严重，请问大家怎么能p出条带，避免引物二聚体的出现？引物啊现在已经是0.5ul了

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1楼 2017-01-31 11:04:20
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

976592787

木虫 (正式写手)

国家自然科学基金委员会委员长
★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-01-31 21:35:55
引物浓度多大的，是10uM的吗，该不会是100uM的吧？标准的使用应该是50ul体系用1ul，我们用菌液pcr只使用体系10ul，不知道你用的什么酶，taq还是pfu或者primerstar酶？是什么模板啊，待验证质粒的还是已验证的用来p片段做克隆的啊，你不说清楚怎么给你解决？

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耻与众草之为伍，何亭亭而独芳！何不为人之所赏兮，深山穷谷委严霜。
3楼2017-01-31 20:09:37
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普通回帖

贾子阳009

铜虫 (小有名气)
★
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你这是在实验室做实验吗？

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2楼2017-01-31 11:13:00
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裤头村的稻米

新虫 (小有名气)
★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-01-31 21:36:13
菌沾一下下就行，我做的是青枯，在选择培养基上培养出来的单菌落条带不是很亮，纯培养以后条带很亮，二聚体很少。

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4楼2017-01-31 20:43:05
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痞子无敌

金虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
3楼: Originally posted by 976592787 at 2017-01-31 20:09:37
引物浓度多大的，是10uM的吗，该不会是100uM的吧？标准的使用应该是50ul体系用1ul，我们用菌液pcr只使用体系10ul，不知道你用的什么酶，taq还是pfu或者primerstar酶？是什么模板啊，待验证质粒的还是已验证的用来p片 ...

大神，酵母接触过吗？

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当你当你的眼睛眯着笑
5楼2017-02-01 08:42:34
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strmond

铁虫 (小有名气)
★
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第一，很可能是假阳性克隆；第二，调一下退火温度。第三，目的条带多大，是用何种酶PCR

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6楼2017-02-01 09:14:48
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生物药学

新虫 (小有名气)
目的条带500bp,用的green mix.做的宏基因组文库的筛选，

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7楼2017-02-01 11:49:40
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生物药学

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by strmond at 2017-02-01 09:14:48
第一，很可能是假阳性克隆；第二，调一下退火温度。第三，目的条带多大，是用何种酶PCR

退火调高还是调低？为什么会出现这么多二聚体呢？

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8楼2017-02-01 11:50:25
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生物药学

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 976592787 at 2017-01-31 20:09:37
引物浓度多大的，是10uM的吗，该不会是100uM的吧？标准的使用应该是50ul体系用1ul，我们用菌液pcr只使用体系10ul，不知道你用的什么酶，taq还是pfu或者primerstar酶？是什么模板啊，待验证质粒的还是已验证的用来p片 ...

我的引物浓度10um，用的green. mix酶，做宏基因组文库的筛选，用于p ks片段，最后测序用。但是之前菌夜pcr还是很好的，现在做菌落pcr为什么引物二聚体这么多么？今天老师说菌的数量有些多，是不是这么个道理，还说泡胶时间要长一些？

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9楼2017-02-01 11:55:30
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strmond

铁虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
8楼: Originally posted by 生物药学 at 2017-02-01 11:50:25
退火调高还是调低？为什么会出现这么多二聚体呢？
...

退火温度低昜出现二聚体

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10楼2017-02-01 13:01:46
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