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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 求助蛋白异源表达的操作过程
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医无止境

木虫 (正式写手)

[求助] 求助蛋白异源表达的操作过程 已有3人参与

大家好，我不是生物化学和分子生物学专业的，想求助一个问题，不知道有没有走错板块。
    我用计算机模拟获得了一个脂肪酶，知道了氨基酸序列，现在想把它在大肠杆菌中表达出来，不知道具体错做步骤是怎么做的。希望大神施以援手，不胜感激。
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yudaoqian88

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1楼 2017-01-16 03:21:23
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hsuley

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
最简单的，找公司按序列合成基因，选择合适的载体质粒构建重组质粒，再转化大肠杆菌诱导表达，收获菌体破碎纯化
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3楼2017-01-16 20:29:36
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yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人

【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2017-01-16 08:06:42
医无止境: 金币+100, ★★★很有帮助, 谢谢，但是我是外行，能不能再说的详细一些 2017-01-19 04:18:02
我也是外行

首先是根据你的氨基酸序列选择合适的核苷酸序列，也就是密码子优化吧，优化后的核苷酸序列在不改变氨基酸序列的前提下更适合大肠杆菌表达蛋白。

得到序列以后，需要公司直接合成，得到模板。

得到模板以后就要根据自己蛋白的特性选择合适的载体系统，然后把序列导入载体。重组质粒转化目标菌株。

最后就是常规的蛋白表达检测和纯化了。也可直接交给公司做…

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特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！
2楼2017-01-16 04:35:02
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梦想天行

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
合成基因，一周搞定！

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4楼2017-01-16 21:27:58
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yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人
送红花一朵
竟然收到一笔巨资！！！

不过我也很外行！

如果身边没有做过类似实验的老师同学朋友可以咨询求助，我感觉你可以找家你们课题或别的课题推荐的做蛋白的公司，把氨基酸序列发给他们，告诉他们你的目的，想在大肠中表达纯化。他们会根据你的需要合成对应的适合大肠杆菌的核苷酸序列，并直接克隆到克隆载体里面。如果你需要，他们甚至可以全程服务，直接把目的蛋白纯化出来给你。

别人都说公司纯化蛋白也挺慢的，有时候效果也一般，我没有弄过，不知道别的公司怎么样。我建议你如果拿到公司提供的连T的质粒以后，自己构建载体纯化蛋白。具体需要用什么载体，也可以根据你的蛋白特性咨询身边或公司资源，比如我听说的膜蛋白、核蛋白什么的，可能在载体选择上有所区别。所以这个你也可以咨询公司。如果公司或者身边资源没有给你最合适的载体，你可以克隆到两个或者三个常用载体上。这样不会耽误太多时间。
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特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！
5楼2017-01-21 16:21:28
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