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doxiaoshi新虫 (小有名气)
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[交流]
有人做个免疫共沉淀吗？
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想做一个beclin和Bcl-2的共沉点，实验室之前没人做个这个。我想请问大神们，有人做过没，从抗体选择到样品处理都要注意什么，越具体越好。谢谢各位虫友 发自小木虫Android客户端 |
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doxiaoshi
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2楼2017-01-17 00:43:58
doxiaoshi
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您好，可否把免疫共沉淀的protocol发给我看看，我也是第一次接触，甚是懵逼，周围也没人做过。 谢谢您。邮箱rohizer@163.com 谢谢您。 |
7楼2017-08-10 23:02:48
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贴一个免疫共沉淀实验的操作步骤： 1.用预冷的磷酸缓冲液洗涤细胞两次，最后一次吸干磷酸缓冲液； 2.加入预冷的RIPA Buffer（1 ml/10^7个细胞、10 cm培养皿或150 cm培养瓶，0.5 ml/5×10^6个细胞、6cm培养皿、75cm培养瓶) 3.用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮离，把悬液转移到干净的1.5ml EP管中。并置于低速摇床，4℃缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）； 4.4℃，14000rpm离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中； 5.将Protein A/G琼脂糖珠用磷酸缓冲盐溶液洗两遍，用磷酸缓冲盐溶液配制成50%的Protein A/G琼脂糖珠工作液，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠； 6.在样品中以每1ml中加100μl的比例，加入50%的Protein A/G琼脂糖珠工作液。水平摇床4℃摇动10min（EP管插冰上，置水平摇床上），该步骤的目的是去除非特异性结合的蛋白； 7.4℃，14000rpm离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A/G琼脂糖珠； 8.做蛋白标准曲线（Bradford 法），测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）； 9.用磷酸缓冲液将总蛋白稀释到1μg/μl以降低裂解液中去垢剂的浓度。如果觉得你的目的蛋白的浓度低了，可以将总蛋白浓度提高到10μg/μl（假设浓度足够）; 10.加入一定体积的抗体到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因与它有作用的蛋白在不同细胞系中的多少而异； 11.4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h；激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2h室温孵育； 12.加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2μl过渡抗体； 13.14000rpm瞬时离心5s，收集沉淀，并且用预冷的洗涤缓冲液（或者预冷的磷酸缓冲盐溶液）洗涤3遍（每次加入800μl），RIPA Buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用磷酸缓冲盐溶液； 14.用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）； 15.以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性； 有不对的地方欢迎各位虫友批评指正。 |
8楼2018-04-25 09:54:03
