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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物信息 » 6 × His标记蛋白定量
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1322324659

新虫 (小有名气)

[求助] 6 × His标记蛋白定量 已有1人参与

本人使用真核细胞质粒表达载体表达一个目的蛋白，由于没有一抗可以使用，所以在目的蛋白末端加了6×His，现在需要对这个蛋白进行定量检测，使用WB的话定量结果又不太可信，想用ELISA试剂盒检测，但是找不到His的定量试剂盒。

度娘上只搜到一个半定量的试剂盒，但是看那个试剂盒说明书感觉不靠谱。附上链接：
http://www.genscript.com.cn/prod ... on-and-purification

哪位前辈有用过？给小弟推荐一个吧
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1楼 2017-01-12 22:33:51
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bush119

木虫 (职业作家)

灌水高手
蛋白定量呗？BCA？
难道说表达量特别低？
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2楼2017-01-13 10:05:28
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yxncas-2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感觉好奇怪哈，蛋白质定量干嘛要上一抗或者WB这样的方法呢？蛋白定量自己就很多方法，简单直接，何必那么绕？
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3楼2017-01-13 14:55:40
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1322324659

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yxncas-2012 at 2017-01-13 14:55:40
感觉好奇怪哈，蛋白质定量干嘛要上一抗或者WB这样的方法呢？蛋白定量自己就很多方法，简单直接，何必那么绕？

不是普通的蛋白，没法纯化。
不是那种双缩脲法能随便计算的
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4楼2017-01-13 22:07:30
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1322324659

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bush119 at 2017-01-13 10:05:28
蛋白定量呗？BCA？
难道说表达量特别低？

表达量确实比较低，单位需要计算成 IU/ml。
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5楼2017-01-13 22:08:42
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bush119

木虫 (职业作家)

灌水高手
引用回帖:
5楼: Originally posted by 1322324659 at 2017-01-13 22:08:42
表达量确实比较低，单位需要计算成 IU/ml。...

是不是转染效率低 或者细胞株有关？
异源表达载体用的什么？
通常强启动子不会表达量这么低的
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6楼2017-01-16 08:19:54
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1322324659

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by bush119 at 2017-01-16 08:19:54
是不是转染效率低 或者细胞株有关？
异源表达载体用的什么？
通常强启动子不会表达量这么低的...

载体用的pcDNA3.1(-)，细胞系用293。
问题是无论表达量高低，我都不能用普通的总蛋白测定方法。
因为要进行免疫检测仪器之间检测性能的对比，所以必须用酶免疫方法检测目的蛋白。
之所以插入标记蛋白，并检测标记蛋白，就是为了以插入蛋白的检测结果作为不同仪器之间的统一标准。
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7楼2017-01-16 09:50:10
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bush119

木虫 (职业作家)

灌水高手
引用回帖:
7楼: Originally posted by 1322324659 at 2017-01-16 09:50:10
载体用的pcDNA3.1(-)，细胞系用293。
问题是无论表达量高低，我都不能用普通的总蛋白测定方法。
因为要进行免疫检测仪器之间检测性能的对比，所以必须用酶免疫方法检测目的蛋白。
之所以插入标记蛋白，并检测标 ...

目的蛋白进行纯化了么？富集一下？
如果一定要用His抗体的话 方法也很简单 His单抗通常是鼠抗 把你要测的蛋白做一个梯度浓度包被 加入His单抗 二抗用羊抗鼠或兔抗鼠（带HRP或者其他标记的），用试剂盒里的已知蛋白做标准对照 如果有带his的已知蛋白标准品就不需要买试剂盒了（随便找个原核载体做个表达纯化一下标签蛋白，不到两个星期就能得到）
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8楼2017-01-16 12:30:30
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ayeruu016
9楼2017-08-21 08:20:49
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