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1137977621

新虫 (初入文坛)

[求助] 镍柱纯化蛋白有杂带怎么办 已有1人参与

求助各位大神,最近在镍柱纯化蛋白,用的是NZ9000体系,蛋白大小为32KD,总是在15KD左右有条杂带,和我要的蛋白洗脱浓度一样样的,感觉和镍柱也结合的很好啊。。。。试过二次纯化,但是也不行。怎么办呢?图中从右至左依次是Marker 、总蛋白、洗脱液、50mM咪唑、100mM咪唑、150mM咪唑、200mM咪唑、250mM咪唑、500mM咪唑第一次、500mM咪唑第二次。想问一下如果接着用10KD的超滤离心柱离心,能把那个小的杂蛋白离掉吗?

镍柱纯化蛋白有杂带怎么办
003.jpg
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刘志华

金虫 (正式写手)

是不是可以改良一下你washing buffer的PH,看看有没有效果

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2楼2017-01-03 13:25:05
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1137977621

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 刘志华 at 2017-01-03 13:25:05
是不是可以改良一下你washing buffer的PH,看看有没有效果

我现在pH用的是7.4, 要怎么改呢?再小一点还是大一点?
3楼2017-01-03 13:38:59
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十四_14

荣誉版主 (正式写手)

二次纯化用的什么方法?也是镍柱?

感觉你每种咪唑浓度都有目的蛋白掉下来
4楼2017-01-03 16:47:42
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1137977621

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 十四_14 at 2017-01-03 16:47:42
二次纯化用的什么方法?也是镍柱?

感觉你每种咪唑浓度都有目的蛋白掉下来

二次纯化也是镍柱,但是最下面那条杂带还是会和目的条带一起出现
5楼2017-01-04 09:17:54
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十四_14

荣誉版主 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 1137977621 at 2017-01-04 09:17:54
二次纯化也是镍柱,但是最下面那条杂带还是会和目的条带一起出现
...

通常这种情况下镍柱二次纯化效果也不会太好  因为杂带也是能够结合镍柱的  所以你再用镍柱效果还是一样的啊  

但是你可以考虑二次纯化时改用别的办法  比如离子交换
6楼2017-01-04 10:36:16
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1137977621

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 十四_14 at 2017-01-04 10:36:16
通常这种情况下镍柱二次纯化效果也不会太好  因为杂带也是能够结合镍柱的  所以你再用镍柱效果还是一样的啊  

但是你可以考虑二次纯化时改用别的办法  比如离子交换...

哦哦 ,那这种带组氨酸标签的一般过什么离子交换柱?
7楼2017-01-04 13:04:14
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十四_14

荣誉版主 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 1137977621 at 2017-01-04 13:04:14
哦哦 ,那这种带组氨酸标签的一般过什么离子交换柱?...

这个就跟你的蛋白有关系了  与标签无关

具体的你可以参考一下GE的蛋白纯化手册  里面说的很全面
8楼2017-01-04 13:50:16
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淘七九懒

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

楼主,你可以在低浓度咪唑多进行洗脱,在确定能洗脱的咪唑浓度下保留一段时间洗脱
9楼2017-01-06 15:32:43
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1137977621

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 淘七九懒 at 2017-01-06 15:32:43
楼主,你可以在低浓度咪唑多进行洗脱,在确定能洗脱的咪唑浓度下保留一段时间洗脱

之前试过了,杂蛋白在低浓度也洗不下来,高浓度又下来了
10楼2017-01-06 16:14:54
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