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zgmmyp

金虫 (小有名气)

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专业: 临床分子生物学检验

[交流] 组织匀浆！！！！弱弱的问题！但是很急！谢谢各位大侠！

组织匀浆！！！！弱弱的问题！但是很急！谢谢各位大侠！
我要研究鱼类肝脏组织内的蛋白质，是一种在肝脏内合成然后分泌到血液中的蛋白质。我想取肝脏制成匀浆，跑SDS-PAGE观察。这种蛋白对热比较敏感。在这里想请教各位大侠，我用什么匀浆方法比较好？用PMSF做蛋白酶抑制剂可以吗？制备匀浆的时候用什么匀浆缓冲液比较好？
谢谢各位！！

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烦躁已经有5人回复

1楼 2008-12-10 14:22:10

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winfly

金虫 (小有名气)

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专业: 临床检验新技术

★
zgmmyp(金币+1):谢谢参与

可有以下方法：
1.冻融法：将材料置低温冰箱，结冰以后在提高温度融化，反复作几次，可以破坏细胞膜，前提是你的提取蛋白要禁得起温度考验。
2.超声匀浆，使用冰水介质，防止温度过高，这个比较常用，特别是处理的样本量比较少时。
3.匀浆机，有研磨式和内切式，我更青睐内切式，不同的刀头可以处理不同量的样本。不要持续匀浆时间过长，防止温度升高，也可以和第一中方法结合使用，即冰冻以后进行匀浆处理，效果更佳，但必须专门购置设备，性能好点的价格不菲。

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2楼2008-12-10 16:22:06

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zgmmyp

金虫 (小有名气)

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专业: 临床分子生物学检验

谢谢winfly的回复！
看来只能用超声了！谢谢

3楼2008-12-11 10:10:55

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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

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★
zgmmyp(金币+1):谢谢参与

用液氮研磨，这是最常用的方法，而且也非常彻底，同时还能防止蛋白降解
要用超声，就必需保证容器与冰水重复接触防止局部升温太高
PMSF可以用，要新制的，因为PMSF在水相中的半衰期很短（以分钟计的……忘了多少，似乎30min）

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4楼2008-12-11 10:21:07

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zhijiangli

金虫 (正式写手)

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专业: 作物杂种优势及其利用

★
zgmmyp(金币+1):谢谢参与

没有做过动物的

只做过植物用的是液氮

祝楼主实验顺利

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缘分这东西O(∩_∩)O~

5楼2008-12-11 16:26:44

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zhwenxing

木虫 (著名写手)

尛森蟲

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★
zgmmyp(金币+1):谢谢参与

可以考虑用液氮。比较放心

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6楼2008-12-11 17:05:29

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shuixinshi

银虫 (小有名气)

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专业: 海洋监测、调查技术

★
zgmmyp(金币+1):谢谢参与

楼上说的都很好啊但是我觉得液氮反复冻融会不会大量破坏蛋白

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7楼2008-12-12 13:54:56

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zgmmyp

金虫 (小有名气)

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专业: 临床分子生物学检验

谢谢各位！
用液氮的话太麻烦了因为我的样品数量太多了！有48个！那样的话我一天液研不完.我以前用的是超声！发现就是比较容易产生热，对蛋白很不好！这次是不做的试验，所以想求助大家，找个好的匀浆方法！

谢谢各位！这次再试一下看看吧。。。
祝福各位达人！！

8楼2008-12-14 10:31:11

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