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307无尘

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白纯化问题 已有2人参与

最近在做蛋白纯化问题,一直纯化不出来,主要是目的蛋白都挂不上镊柱!需要说明的是,我是用AKTA仪器纯化的,镊柱是重新再生过的,别人一起纯化,他都可以纯化出来。
        刚开始用PH7.4的A(20mM咪唑),B(500mM咪唑)液进行纯化,结果目的蛋白都没有挂上镊柱,后来换成PH8.0的A(不含咪唑),B(500mM咪唑)液还是挂不上镊柱,这倒是是怎么回事呀?求各位大神支招!不胜感激!!!
        PS:我的蛋白是真核蛋白,分子量17KDa,用28a载体在BL21DE3中进行可溶性表达,然后再去纯化

@biostar2009 发自小木虫Android客户端
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Xyuan170103

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 307无尘 at 2016-12-27 13:24:50
我有拿去做Western Blot过,能够显示出我的目的条带,那应该就是没有被包裹住的可能吧?
...

呃,跑胶之前有对蛋白样进行处理吧,属于变性电泳,此时蛋白是线性的一级结构,HIS能够完全暴露出来。而蛋白在自然状态下,HIS可能被蛋白的高级结构包裹起来,导致不挂柱
6楼2017-01-04 12:46:18
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