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307无尘

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白纯化问题 已有2人参与

最近在做蛋白纯化问题，一直纯化不出来，主要是目的蛋白都挂不上镊柱！需要说明的是，我是用AKTA仪器纯化的，镊柱是重新再生过的，别人一起纯化，他都可以纯化出来。
        刚开始用PH7.4的A（20mM咪唑）,B（500mM咪唑）液进行纯化，结果目的蛋白都没有挂上镊柱，后来换成PH8.0的A（不含咪唑），B（500mM咪唑）液还是挂不上镊柱，这倒是是怎么回事呀？求各位大神支招！不胜感激！！！
        PS:我的蛋白是真核蛋白，分子量17KDa，用28a载体在BL21DE3中进行可溶性表达，然后再去纯化

@biostar2009 发自小木虫Android客户端
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1楼 2016-12-25 23:16:29
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能是你的标签被包裹，不能发挥作用。
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2楼2016-12-26 16:47:54
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hienzyme

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-12-27 07:25:12
如果你的蛋白挂柱弱，不带咪唑时，背景蛋白更多结合在Ni柱上，可用的位点更少。
建议你可以改变His-tag融合的位置，如N端改C端，用pET21a,或者设计引物时带8个his甚至10个。
如果蛋白表达没问题，也可以根据等电点选择合适的离子柱纯化方案。
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海恩泽生物科技
3楼2016-12-27 01:15:01
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307无尘

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2016-12-26 16:47:54
可能是你的标签被包裹，不能发挥作用。

我有拿去做Western Blot过，能够显示出我的目的条带，那应该就是没有被包裹住的可能吧？

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4楼2016-12-27 13:24:50
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 307无尘 at 2016-12-27 13:24:50
我有拿去做Western Blot过，能够显示出我的目的条带，那应该就是没有被包裹住的可能吧？
...

WB的样品是变性蛋白
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5楼2016-12-28 09:45:43
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Xyuan170103

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 307无尘 at 2016-12-27 13:24:50
我有拿去做Western Blot过，能够显示出我的目的条带，那应该就是没有被包裹住的可能吧？
...

呃，跑胶之前有对蛋白样进行处理吧，属于变性电泳，此时蛋白是线性的一级结构，HIS能够完全暴露出来。而蛋白在自然状态下，HIS可能被蛋白的高级结构包裹起来，导致不挂柱
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6楼2017-01-04 12:46:18
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xudech

木虫 (正式写手)

xiaochong
变性后过个试试 然后复性

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7楼2017-01-04 15:52:46
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