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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 跪求大神啊！——减少模板量之后染色体步移没条带了
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一本正经胡说

新虫 (初入文坛)

[求助] 跪求大神啊！——减少模板量之后染色体步移没条带了

本科生做毕设第一次PCR就是染色体步移啊，求大神赐教。
       用的是Takara家的geneme walking，寻找对虾p53基因启动子。
       前期设计了三个引物，第一次提了虾卵基因组DNA，模板浓度是93.93ng/ul.
       看说明书第一次跑要0.1~1ug所以加了8ul模板，跑的25ul体系，退火温度56°C
       （说明书上是60°以上但试过了一点条带没有，引物本身Tm不高，所以就定为56°C）
        然后这是第一次跑的结果（marker2K+，最亮的750）：依次AP2，AP3，AP4，maker
      
 \"跪求大神啊！——减少模板量之后染色体步移没条带了\"

        P.S.  有大神知道为什么点样孔这么亮吗？
       一开始AP4挺亮的很开心，然后每次都基本不变条件，结果AP4第三次就是这样：

跪求大神啊！——减少模板量之后染色体步移没条带了-1
   
       跟老师说了以后老师说模板量太多，只用1ul就好。我又重提了一次DNA，浓度有124ng/ul，我又用2ulAP4跑了第一次（其他条件不变）：

跪求大神啊！——减少模板量之后染色体步移没条带了-2

      这下一点条带都没有了啊！求大神指教，我接下来该怎么办？
      是继续做第二次？还是改一下条件，温度模板量啥的，我看网上说模板至少3ug是吗？还是因为我引物设计有问题？模板260/280是1.8几，260/230是4。。。
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1楼 2016-12-22 15:28:42
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一本正经胡说

新虫 (初入文坛)
补一下第一张图

 \"跪求大神啊！——减少模板量之后染色体步移没条带了-3\"
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2楼2016-12-22 15:30:57
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一本正经胡说

新虫 (初入文坛)
跪求大神啊！——减少模板量之后染色体步移没条带了-4
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3楼2016-12-22 15:32:23
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小小蜂王

禁虫 (文坛精英)

坏蛋

优秀版主优秀版主
好像很久不来小木虫了~

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2016-12-22 16:18:21
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陈嘉毅

至尊木虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-23 07:42:04
做下温度梯度试试，改变下模板引物浓度也试下，摸出一个最佳的条件，引物特异性最好验证下，避免二聚体形成。
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哈哈哈哈哈哈！
5楼2016-12-22 20:12:15
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一本正经胡说

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 陈嘉毅 at 2016-12-22 20:12:15
做下温度梯度试试，改变下模板引物浓度也试下，摸出一个最佳的条件，引物特异性最好验证下，避免二聚体形成。

嗯嗯，好哒⊙▽⊙谢谢！

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6楼2016-12-22 23:45:14
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一本正经胡说

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 陈嘉毅 at 2016-12-22 20:12:15
做下温度梯度试试，改变下模板引物浓度也试下，摸出一个最佳的条件，引物特异性最好验证下，避免二聚体形成。

其实温度有试过，60上下试过几次，还是56，57比较好。引物浓度是照着说明书。就怕模板量不合适，不敢加多也不敢加少。

发自小木虫Android客户端
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7楼2016-12-22 23:49:21
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