24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
查看: 3346  |  回复: 22
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

清嗓金声

铜虫 (初入文坛)


[求助] 重叠延伸PCR扩拼接片段时弥散,怎样解决?已有8人参与

为扩增一个3.8kb的条带,分两段扩,然后拼接,两段都已切胶回收。重叠区181bp,拼接时用过两步法,退火延伸一起72℃3min。38循环
也试过一般的三步。跑出来没有条带,全弥散。求解决办法,谢谢各位大神!!!

发自小木虫Android客户端
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

浮笙若梦

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

3.8k也不长,为什么要分段扩呢?要是想克隆PCR用高保真酶不是更好
21楼2016-12-28 15:28:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 23 个回答

仇峰12306

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-02 21:29:12
你们重叠区这么长181bp,一般你都是这么做的吗?我重叠部分一般都是25-30bp。我没有P过这么长的,181bp那你退火温度是多少啊?
2楼2016-12-02 14:20:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Alice 2016

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-02 21:28:50
其实我一直不太明白,为什么要做重叠PCR,而不做多片段克隆呢?结果都是一样的啊,而且还省了连载体的过程。我上个月才用诺唯赞的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit连过四个片段的,加起来大概8k左右,一次就成功了,楼主可以尝试换个思路试试。希望对你有帮助。
怕什么真理无穷,进一寸有一寸的欢喜
3楼2016-12-02 15:36:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sky蒲公英

版主 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主

知识就像蒲公英的花儿一样,播种在世界的每一个角落。
4楼2016-12-03 09:17:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
信息提示
请填处理意见