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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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漫步青苔

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR相关 已有4人参与

之前p的时候，特异性很好，条带也很亮，但是最近p一直p不出来，换了新一管同样的引物和cDNA也是p不出来，第一个图是之前p的，第二个图是最近p的，实验新手请大神赐教

PCR相关


PCR相关-1


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1楼 2016-12-01 09:18:56
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

Alice 2016

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-12-04 22:28:02
你的cDNA逆转出来多久啦？会不会引物和模板存在降解呢？我之前用的phanta max扩过cDNA，也是这样的，后来咨询了他们技术，从以下方面做了改进，然后就扩出了很好看的条带，你可以参考一下！
原因
1. 引物特异性差
2. 引物或模板浓度太高
3. 酶或镁离子浓度偏高
4. 退火温度偏低
5. 循环次数太多
对策
1. 重新设计引物或使用巣式PCR
2. 适当降低引物和模板浓度
3. 适当降低酶量或镁离子浓度
4. 提高退火温度
5. 适当降低循环次数
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怕什么真理无穷，进一寸有一寸的欢喜
2楼2016-12-01 09:30:37
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普通回帖

jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-04 22:28:45
样品的问题吧，引物在低温储存时质量不会有太大变化
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3楼2016-12-01 16:09:15
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漫步青苔

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Alice 2016 at 2016-12-01 09:30:37
你的cDNA逆转出来多久啦？会不会引物和模板存在降解呢？我之前用的phanta max扩过cDNA，也是这样的，后来咨询了他们技术，从以下方面做了改进，然后就扩出了很好看的条带，你可以参考一下！
原因
1. 引物特异性差 ...

从新提的RNA，逆转录以后再p还是这样

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4楼2016-12-04 21:04:01
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sky蒲公英

版主 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-12-04 22:29:01
可以把你之前的PCR产物回收后，以此为模板进行二次PCR。我刚试过，也是前几次p出来了，后面死活出不来结果。
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知识就像蒲公英的花儿一样，播种在世界的每一个角落。
5楼2016-12-04 21:16:01
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

我也碰到过，我的办法就是全换新试剂，去一个新的实验室配置，在用一台新的PCR仪器P.(这台PCR仪器也要放在新实验室的)。2次实验完全不能有一样的东西出现，祝你好用。
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采菊东篱下，悠然见南山。
6楼2016-12-05 08:24:55
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snhajn

新虫 (著名写手)
换个新的酶吧

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7楼2016-12-05 08:45:54
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漫步青苔

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 781055707 at 2016-12-05 08:24:55
我也碰到过，我的办法就是全换新试剂，去一个新的实验室配置，在用一台新的PCR仪器P.(这台PCR仪器也要放在新实验室的)。2次实验完全不能有一样的东西出现，祝你好用。

我试试

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8楼2016-12-07 10:24:38
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漫步青苔

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sky蒲公英 at 2016-12-04 21:16:01
可以把你之前的PCR产物回收后，以此为模板进行二次PCR。我刚试过，也是前几次p出来了，后面死活出不来结果。

之前p的已经用光了

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9楼2016-12-07 10:25:15
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Ivy尘

新虫 (正式写手)
最近也是……

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10楼2016-12-07 13:27:57
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