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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR扩增之前能扩出来，现在同样条件也扩不出来了
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upgo123

金虫 (小有名气)

[求助] PCR扩增之前能扩出来，现在同样条件也扩不出来了 已有2人参与

如题，我用的
dntp~~200uM
模板量小于100ng,
酶量1.5U,
引物0.5uM,
DMSO~~4%,
反应体系20ul。
为什么会出现图中那种结果呢？

@biostar2009 [ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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选择，然后坚持
1楼 2016-12-01 00:35:23
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upgo123

金虫 (小有名气)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-12-01 05:59:39
PCR产物电泳图
PCR扩增之前能扩出来，现在同样条件也扩不出来了



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选择，然后坚持
2楼2016-12-01 00:42:07
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rainboy3529

铁虫 (著名写手)
循环次数太多吧

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3楼2016-12-01 08:43:43
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Alice 2016

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
突然觉得非特异性扩增好常见呀，你可以从以下几个方面做一下尝试：
原因
1. 引物特异性差
2. 引物或模板浓度太高
3. 酶或镁离子浓度偏高
4. 退火温度偏低
5. 循环次数太多
对策
1. 重新设计引物或使用巣式PCR
2. 适当降低引物和模板浓度
3. 适当降低酶量或镁离子浓度
4. 提高退火温度
5. 适当降低循环次数
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怕什么真理无穷，进一寸有一寸的欢喜
4楼2016-12-01 09:55:16
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rhapsody007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

如果之前能扩出来，那就把DNTP，引物、酶和模板，都换成新的试试。有可能是其中某些试剂反复使用，变质了、、
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吉恩特磁珠
5楼2016-12-04 10:57:58
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路过雨季

新虫 (初入文坛)
楼主解决了没？我也遇到这问题

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6楼2017-04-08 17:46:17
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