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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助:通用引物问题,谢谢!
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zhangxi008398

银虫 (小有名气)

[交流] 求助:通用引物问题,谢谢!

我筛选了几株细菌,正在做16SrRNA鉴定,我就用细菌的通用引物:
正向引物:AGAGTTT GATCCTGGCTCAG
反向引物: AAGGAGGTGATCCAGCCGCA   
   PCR体系:基因组  2uL
               正向引物  2uL
               反向引物   2uL
             10*PCR  buffer(Mg2+)   5uL  
             dNTP        2uL
             Taq酶     2uL
             ddH2O      36uL                                 
但是PCR的产物跑胶条带不亮,测序公司说PCR产物条带弱不适合测序.请问是我引物有问题还是PCR体系有问题还是别的原因,谢谢!

[ Last edited by zhangxi008398 on 2008-12-5 at 08:59 ]
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1楼 2008-12-05 08:53:52
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eaglezheng

铁虫 (小有名气)
Taq酶太多了，两个单位足够了  引物20pm各用1uL就够了，dNTP量少了要翻一倍。体系可以自己慢慢摸索
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5楼2008-12-05 19:48:43
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bbyu007

木虫 (正式写手)
总感觉你的体系有问题，减点别的或加点别的
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我是笨笨鱼~~~
2楼2008-12-05 09:13:36
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户
介绍体系的时候不要光给加的液体的体积，是不是也应该把浓度告诉大家啊，还有PCR的循环参数什么的？引物的Tm？
赞一下 回复此楼
金币是赌出来的
3楼2008-12-05 13:48:16
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zhangxi008398

银虫 (小有名气)
PCR体系:基因组  2uL
               正向引物(20pmol/ul)  2uL   Tm 60
               反向引物(20pmol/ul)    2uL  Tm 64            
               10*PCR  buffer(15mM Mg2+)   5uL  
             dNTP (2.5mM )       2uL
             Taq酶(5u/ul)     2uL
             ddH2O      36uL       35个循环, 94(30S)-60(30S)-72(1min20s)35个循环,72 (5min)         谢谢!!
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4楼2008-12-05 14:51:59
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