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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 经过BCA定量后，WB时内参依然不齐，而且异常诡异
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煮啊煮小鱼

铁虫 (初入文坛)

[求助] 经过BCA定量后，WB时内参依然不齐，而且异常诡异 已有3人参与

小弟刚开始做WB实验 具体步骤如下

首先样品是前面师兄冻存在负八十里的，

分 正常组，模型组，给药组 三组动物组织

每次蛋白分装定量取20微克组织+200微升 RIPA+PMSF 剪刀尽量剪碎后超声，冰上15min后离心，紧接着BCA定量

分装时每管20微升的体系 蛋白量30~60微克，其余用LB和pbs补齐

所有操作都是尽可能的低温 离心管离心机提前预冷


下面是重点


所有的内参tubulin 全部都是 加药组深 模型组其次 正常组最浅

提了三次蛋白了 做了8块胶了 几乎都是一毛一样的趋势 就不发多张图了
经过BCA定量后，WB时内参依然不齐，而且异常诡异

虽然tubulin这么不齐 但是目的蛋白齐啊
本该是给药组最深的目的蛋白 在正常组tubulin非常浅的情况下 硬生生的和目的
蛋白一个水平了
经过BCA定量后，WB时内参依然不齐，而且异常诡异-1

另外一个目的蛋白正常组也没表现出和tubulin相似的 该有的少量
经过BCA定量后，WB时内参依然不齐，而且异常诡异-2


各位大神帮忙看看 小弟现在真是不知道怎么办了
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1楼 2016-11-22 10:08:21
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丑丑小地

新虫 (小有名气)
1是某一实验组全提取完，混匀后，分装2

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2楼2016-11-22 14:38:46
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煮啊煮小鱼

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 丑丑小地 at 2016-11-22 14:39:16
2实在不行重新做标曲

我师妹也用的这个标曲 她提的细胞蛋白就没什么问题
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6楼2016-11-23 16:25:11
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普通回帖

丑丑小地

新虫 (小有名气)
2实在不行重新做标曲

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3楼2016-11-22 14:39:16
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liuye1990

禁虫 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
4楼2016-11-23 09:19:59
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star013

新虫 (知名作家)
我们可以提供wb技术服务哈

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5楼2016-11-23 09:35:19
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顾钱思厚

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我的目的条带很亮，但内参不是很亮。什么原因呢？？？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2016-11-23 21:55:03
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煮啊煮小鱼

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 顾钱思厚 at 2016-11-23 21:55:03
我的目的条带很亮，但内参不是很亮。什么原因呢？？？

内参曝光久一点吧 或者增加一抗浓度？ 可能目的蛋白本身丰度就高吧 有看到说这种情况分两张膜做的 一个专门跑目的蛋白 一个增加浓度以后测内参
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8楼2016-11-24 16:53:03
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zhuzhu198807

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

BCA测定的是组织内总蛋白的量，但是由于组织内细胞类型比较复杂，所以所测定的某一特定蛋白的浓度并不准确，以所测浓度作为参考电泳，若结果内参不齐，可以根据各条带的灰度对上样量做适当调整，也就是调内参。若是细胞样品的话，BCA测定结果就比较准确了，跑出来基本上内参都是齐的。
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9楼2016-12-07 10:01:06
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博古书生

金虫 (小有名气)
我简接怀疑操作问题，让你师妹或者其他人试试你的样本！

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10楼2018-03-09 12:37:59
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