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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 去磷酸化
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缘生来物

新虫 (小有名气)

[求助] 去磷酸化 已有2人参与

请问体外表达的蛋白质去磷酸化怎么做？实验室有CIP(小牛长碱性磷酸酶)，可以用这个吗？时间、温度、反应体系如何？
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1楼 2016-11-16 21:29:42
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
当然可以用，条件多做自己摸索。
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2楼2016-11-17 10:00:18
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lubuddy

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
缘生来物: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2016-12-21 20:08:27
可以用CIP，反应温度是37摄氏度，我一般处理时间是2小时左右，然后中间一直旋转孵育。注意，加蛋白酶抑制剂会比较好。
我用的buffer终浓度是100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol, pH 7.9。

样品最好是IP下来或者纯化后的，体系用50微升应该没问题。

你可以再查一下这篇文献参考一下：Kornhauser, J. M., Cowan, C. W., Shaywitz, A. J., Dolmetsch, R. E., Griffith, E. C., Hu, L. S., Haddad, C., Xia, Z., and Greenberg, M. E. (2002) CREB transcriptional activity in neurons is regulated by multiple, calcium-specific phosphorylation events. Neuron 34, 221-233
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3楼2016-11-24 20:20:32
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缘生来物

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lubuddy at 2016-11-24 20:20:32
可以用CIP，反应温度是37摄氏度，我一般处理时间是2小时左右，然后中间一直旋转孵育。注意，加蛋白酶抑制剂会比较好。
我用的buffer终浓度是100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol, pH 7 ...

买来的酶（NEB的）有配套的buffer，不过说明书上都是说这酶用来去磷酸化DNA 的，所以这个buffer能用来切蛋白吗？还是要按照你给的buffer浓度？
另外，你放37度，2h,, 蛋白降解的厉害吗？
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4楼2016-12-21 21:46:30
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lubuddy

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 缘生来物 at 2016-12-21 21:46:30
买来的酶（NEB的）有配套的buffer，不过说明书上都是说这酶用来去磷酸化DNA 的，所以这个buffer能用来切蛋白吗？还是要按照你给的buffer浓度？
另外，你放37度，2h,, 蛋白降解的厉害吗？...

可以用来给蛋白质去磷酸化的，你用他们配套的buffer或者我的配方都可以。

如果担心讲解，就加入蛋白酶抑制剂。然后你对照组也是加入buffer里面37度两小时，所以如果有降解也没关系，对照组和处理组还是一样的蛋白量。
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5楼2016-12-23 15:45:03
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蔡小蕾99

新虫 (小有名气)
求问你们用之前会把他分装吗？有没有具体的浓度和溶解液？

发自小木虫Android客户端
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6楼2017-07-20 16:43:35
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黑素奇蝶

金虫 (小有名气)
楼主做出来了吗,酶量大致在什么范围? 谢谢
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7楼2018-08-31 16:47:53
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