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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光探针问题
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huoqing

银虫 (初入文坛)

[求助] 荧光探针问题

本人新手一枚，刚接触荧光PCR（基因分型），希望各位能帮忙回答！
未加Taqman探针时，引物可以扩增出目的条带；在Mx 3000P上同样的体系和程序却未检测到荧光信号。对添加探针的反应体系是否可以扩出目的基因进行验证，结果发现在常规PCR中扩增出现非特异条带，一条带比目的条带小，一条比目的条带大，同时也有目的基因。求解释！
Taqman MGB探针在常规PCR体系中是否具有引物的作用？即3‘端脱氧核糖核苷酸是否能在DNA聚合酶的作用下进行延伸反应？
如果有了解的人能否告知荧光基团和猝灭基团在核苷酸上的具体位置，是否在形成磷酸二脂键的位置？
在此先谢谢各位网友！
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1楼 2016-11-15 21:32:30
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timero

新虫 (小有名气)
不会延伸的，不论是3/5端都是接在羟基上的。

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2楼2016-11-16 06:27:48
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huoqing

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by timero at 2016-11-16 06:27:48
不会延伸的，不论是3/5端都是接在羟基上的。

好的，谢谢！
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3楼2016-11-16 10:03:21
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huoqing

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by timero at 2016-11-16 06:27:48
不会延伸的，不论是3/5端都是接在羟基上的。

你好，能解答下为什么探针加入PCR体系中减弱了引物的特异性吗？

第一张图是普通PCR体系，未加探针；第二张图是加了探针之后扩增的胶图，有什么具体办法可以解决吗？目前退火温度已经是60度。
荧光探针问题
EOBK2FHI]%PGPRFTKC[Z40G.png


荧光探针问题-1
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4楼2016-11-16 11:23:16
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timero

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by huoqing at 2016-11-16 11:23:16
你好，能解答下为什么探针加入PCR体系中减弱了引物的特异性吗？

第一张图是普通PCR体系，未加探针；第二张图是加了探针之后扩增的胶图，有什么具体办法可以解决吗？目前退火温度已经是60度。

EOBK2FHI]%PGPRFT ...

我觉得可能是这个MGB探针合成的有问题，整个粹灭基团有部分脱落，导致扩增。可以重新合成试下

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5楼2016-11-16 18:55:37
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huoqing

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by timero at 2016-11-16 18:55:37
我觉得可能是这个MGB探针合成的有问题，整个粹灭基团有部分脱落，导致扩增。可以重新合成试下
...

好的，谢谢！
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6楼2016-11-18 08:36:46
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