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Nigori

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[交流] 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备实验已有7人参与

枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备可以：

（1）用于建立枯草芽孢杆菌转化体系；

（2）用于其基因改造；

（3）用于提高枯草芽孢杆菌生产性能相关研究。

实验材料

枯草芽孢杆菌168

试剂、试剂盒：SPI 培养基、EGTA、SPII 培养基、柠檬酸钠、EGTA、氢氧化钠、KH2PO4、K2HPO4、MgCl2、MgSO4、葡萄糖酵母膏、( NH4 )2SO4

仪器、耗材：培养箱、培养皿、锥形瓶、紫外分光光度计、接种环、离心管

实验步骤

一、试剂配制

1. SP 盐

0.2%( NH4 )2SO4，1.4% K2HPO4，0.6% KH2PO4， 0.02% MgSO4·7H2O， 0.1% 柠檬酸钠。

2. CAYE (100×)

2 % Casamino acid，10%酵母膏。

3. SPI 培养基

SP 盐溶液加入1 %体积浓度为50%葡萄糖溶液，1 %体积100×CAYE 溶液。

4. SPII 培养基

SPI 培养基加入1 %体积50 mmol/L CaCl2 溶液，1 %体积250 mmol/L MgCl2 溶液。

5. SP-A Salts Solution(500 ml)

（1）0.4% (NH4)2SO4 ：2 g

（2）2.8% K2HPO4·3H2O ：14 g

（3）1.2% KH2PO4 ：6 g

（4）0.2% Trisodium Citrate Dihydrate ：1g

（5）121°C灭菌20 min。

6. SP-B Salts Solution(500 ml)

（1）0.04% MgSO4·7H2O： 0.2 g

（2）121°C灭菌20 min。

7. 100×CAYE Solution(100 ml)

（1）2% Casamino acid ：2 g

（2）10% Yeast Extract：10 g

（3）121°C灭菌20 min。

8. SPI Medium(20 mL)

SP-A Salts Solution：9.8 mL

SP-B Salts Solution：9.8 mL

(1%V)Glucose(50%w/v，115°C灭菌20 min) ：200 μL

(1%V)100×CAYE：200 μL

10. SPII Medium(6 mL)

SPI Medium：5.88mL

(1%V)50mM CaCl2 ：60μL

(1%V)250mM MgCl2：60μL

11. 100×EGTA Solution

10mmol/L EGTA 溶液，溶解时需加少量NaOH 至pH8.0。

二、实验步骤

1. 准备新鲜的168 单克隆平板，取一满环枯草芽孢杆菌甘油菌划LB 平板，37°C 培养箱培养12 h。

2. 转化前一天晚间挑单菌落至3 ml LB 培养基中，37°C，250 r/min 培养过夜。

3. 第二天上午取160 μl 培养液转接至8 ml SPI 培养基中，37°C，250 r/min 培养至对数生长末期(168 约4-5 h)。

4. 取0.2 ml 生长至对数期末的培养液至2 ml SPII 培养基中，37 °C，100 r/min 培养90 分钟。

5. 在上述SPII培养基的菌体中加入20 μl 10mmol/L EGTA，再于37°C，100 r/min 培养10 分钟。

6. 将上述处理后的菌液分装成0.5 ml 每管，各加入5 μl DNA(DNA 量不能过高，不超过5 μg)，再于37 °C，250 r/min 培养90 分钟，取菌液涂布筛选平板。

注意事项

1. 注意仪器用品的干净和无菌。

2. 8ml SPI 培养基要放于50 ml 离心管中培养，以保证菌体的生长状态，不要使用玻璃试管。

3. 注意测定OD值，一定要等菌体生长至对数期后期。

4. 保证菌体的浓度，可以提高转化率。

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