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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 镍柱纯化相关求助
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libin6583802

新虫 (初入文坛)

[交流] 镍柱纯化相关求助 已有7人参与

刚做镍柱纯化，有些不明白，求指导。
请问一下目的蛋白被吸附后，要用咪唑梯度洗脱，可不可以直接用高浓度的咪唑洗脱，不进行梯度啊？
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1楼 2016-11-08 16:45:48
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ylz2433

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4楼: Originally posted by libin6583802 at 2016-11-09 13:36:41
还有一点想问一下，分泌型蛋白可以直接用发酵液过柱子吗？还是需要怎么处理一下？...

pH需要在7-8之间，其他应该没什么问题

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努力，加油！
8楼2016-11-09 15:47:12
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hc-material

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当然可以，只是纯化的纯度可能会受影响，因为镍柱不只吸附目标蛋白，也吸附杂志，拉梯度是为了纯度更高

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12楼2016-11-10 14:08:55
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ylz2433

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kuaile5420: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-11-08 23:13:34
当然不可以喽，直接用高浓度就会把所有的蛋白全部洗脱下来，那上柱子干嘛呢？
梯度洗脱就是用不同浓度的咪唑分别洗脱下与镍柱有不同亲和力的蛋白，亲和力越小，低浓度的咪唑就能洗脱下来，一般是杂蛋白；亲和力越大，所需咪唑浓度就越高了，一般是带有组氨酸的目的蛋白。
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2楼2016-11-08 17:05:23
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XMC-7

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这个也不一定的。情况一：样品较杂，最好梯度洗脱，以获得高纯度的目的蛋白；情况二：样品较纯，需要浓缩时，一步洗脱也可以。其他情况酌情处理，纯化情形复杂多变，多多尝试。
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能帮的帮，难事求助的心情咱也经历过
3楼2016-11-09 10:56:53
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libin6583802

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ylz2433 at 2016-11-08 17:05:23
当然不可以喽，直接用高浓度就会把所有的蛋白全部洗脱下来，那上柱子干嘛呢？
梯度洗脱就是用不同浓度的咪唑分别洗脱下与镍柱有不同亲和力的蛋白，亲和力越小，低浓度的咪唑就能洗脱下来，一般是杂蛋白；亲和力越大 ...

还有一点想问一下，分泌型蛋白可以直接用发酵液过柱子吗？还是需要怎么处理一下？
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4楼2016-11-09 13:36:41
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libin6583802

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by XMC-7 at 2016-11-09 10:56:53
这个也不一定的。情况一：样品较杂，最好梯度洗脱，以获得高纯度的目的蛋白；情况二：样品较纯，需要浓缩时，一步洗脱也可以。其他情况酌情处理，纯化情形复杂多变，多多尝试。

还有一点想问一下，分泌型蛋白可以直接用发酵液过柱子吗？还是需要怎么处理一下？
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5楼2016-11-09 13:40:55
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514278815

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发酵液有的可以直接上，要看发酵液成分，一般建议换液或者透析

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6楼2016-11-09 14:16:10
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ylz2433

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3楼: Originally posted by XMC-7 at 2016-11-09 10:56:53
这个也不一定的。情况一：样品较杂，最好梯度洗脱，以获得高纯度的目的蛋白；情况二：样品较纯，需要浓缩时，一步洗脱也可以。其他情况酌情处理，纯化情形复杂多变，多多尝试。

一般不会用镍柱浓缩吧？为什么不用浓缩管？

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7楼2016-11-09 15:44:37
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XMC-7

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7楼: Originally posted by ylz2433 at 2016-11-09 15:44:37
一般不会用镍柱浓缩吧？为什么不用浓缩管？
...

具体的还是看情况，比如复性回收时。
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能帮的帮，难事求助的心情咱也经历过
9楼2016-11-09 17:16:23
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?o2010

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看你的目的了。不过，具体问题具体分析

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10楼2016-11-09 19:05:47
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