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awaken2013

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 存世孤品 at 2016-10-28 23:56:49
请问能具体一点吗？什么还原剂以及用法用量？如果能挂上感激不尽！
...

还原剂*
5 mM DTE
5 mM DTT
20 mMβ－巯基乙醇
5 mM TCEP
10 mM 还原型谷胱甘肽
都是兼容的（GE的柱子）具体使用浓度看你自己的型号和具体实验操作。
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11楼2016-10-29 15:11:43
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awaken2013

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by mataomatao at 2016-10-29 09:52:17
不要加还原剂，一般5mM DTT镍柱镍已经还原了；包涵体复性，70kd比较困难，还是试试吧，文献很多。最好试试Rosetta 低温看看能不能表达在上清里
...

楼主不是变性都纯不出来嘛，有可能是histag暴露不充分，加点还原剂可能可以消除二硫键封锁的构象。
加还原剂也是下下之策，毕竟达到实验目的才是最重要的。
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12楼2016-10-29 15:21:33
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mataomatao

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
13楼2016-10-29 16:38:46
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huhao0230

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by awaken2013 at 2016-10-29 15:11:43
还原剂*
5 mM DTE
5 mM DTT
20 mMβ－巯基乙醇
5 mM TCEP
10 mM 还原型谷胱甘肽
都是兼容的（GE的柱子）具体使用浓度看你自己的型号和具体实验操作。...

DTT貌似还原性很强，NI扛不住！用新的beads，β－巯基乙醇既能达到还原二硫键的目的，又不会还原NI
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14楼2016-11-02 10:34:26
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yuzaiyutian

铁虫 (小有名气)
直接使用triton洗一下，就已经很纯了，包涵体杂质不又多。过镍柱效果也不一定好。后续如果要复性的话，建议先复性，看看有没有复性成功蛋白。

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15楼2016-11-02 12:05:19
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存世孤品

新虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by yuzaiyutian at 2016-11-02 12:05:19
直接使用triton洗一下，就已经很纯了，包涵体杂质不又多。过镍柱效果也不一定好。后续如果要复性的话，建议先复性，看看有没有复性成功蛋白。

接老师建议先复性后挂柱，结果复性后大量蛋白析出，心痛。。。

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16楼2016-11-02 22:28:06
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yuzaiyutian

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by yuzaiyutian at 2016-11-02 12:05:19
直接使用triton洗一下，就已经很纯了，包涵体杂质不又多。过镍柱效果也不一定好。后续如果要复性的话，建议先复性，看看有没有复性成功蛋白。

很正常的，如果全部可溶那你也太幸运了。你离心后如果上清中还有残留就很不错了。可以试试。另外，复性有风险，选择需谨慎。

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17楼2016-11-02 22:30:56
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存世孤品

新虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by yuzaiyutian at 2016-11-02 22:30:56
很正常的，如果全部可溶那你也太幸运了。你离心后如果上清中还有残留就很不错了。可以试试。另外，复性有风险，选择需谨慎。
...

有啥风险？

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18楼2016-11-03 08:32:09
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yuzaiyutian

铁虫 (小有名气)
做不出来

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19楼2016-11-03 09:23:57
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天际雾影

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 存世孤品 at 2016-10-27 22:14:51
蛋白经过wb检测和elisa检测都是阳性，镍柱也是新的，组氨酸标签氮端和碳端都做了，就是挂不上。。
...

你试试将UREA浓度稀释到4M或者更低时能不能挂上，我的在8M时柱上挂的也不多。尿素可能会影响结合。
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20楼2016-11-21 19:58:37
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