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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请教有关于双酶切后连接反应的有关问题
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足下客

木虫 (正式写手)

[交流] 请教有关于双酶切后连接反应的有关问题

我现在要将一个2.8kb的PCR产物片段连接到一个约7kb大的质粒上（此质粒为自己构建的，是连接了4.3Kb基因的PMD19 T vector) 选用的酶切位点是salI和PstI，宝生物的酶，10*Tango buffer ,连接温度为14度，时间大约为12个小时。
可是我连接了两次都没有成功，不知道问题出在哪儿。希望虫友们指点一下，非常感谢！
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1楼 2008-11-28 09:19:48
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
用NEB的酶就不会有失败的……
takara的酶每次都要做预实验，分别单切和双切看看是否完全
但NEB就可以免去这一步，绝对不会有任何问题
1：10有点夸张啦，其实我做得比较好的都是1：5，1：3差一些，更高的似乎有时候不稳定
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7楼2008-11-28 17:30:11
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
司马诸葛(金币+3,VIP+0):谢谢交流 8-17 10:19
首先确认是否酶切完全了，takara的内切酶非常糟糕，建议用NEB的，不会比takara的贵多少，关键是能够做出实验
同样ligase也是。我用的是TOYOBO的ligation high Ver2，16度 30min就完全连上了。
当然还有考虑你的Vector：Insert（摩尔比）
1：3~1：5是比较恰当的
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2楼2008-11-28 09:59:44
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足下客

木虫 (正式写手)
怪不得呢，有时候双酶切都出来三条带，就是因为酶切不完全，出现了单酶切
我这次把连接温度换成了16度和4度，打算分别连接16小时和24小时。要是再连不上，我就要崩溃了
摩尔比不是在1：3——1：10之间吗？如果PCR产物加的太多会有什么影响呢？
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3楼2008-11-28 10:29:48
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ningluztt

铜虫 (小有名气)
★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-17 10:19
链接时间不用那么长时间，4度过夜完全可以了。你用得是宝生物的酶，酶切之前看一下你使用的两个酶是否可以在同一buffer中酶切，如果两种酶不兼容，那就要分别酶切了。另外，你的酶切片段的量要适当。

适当增加PCR产物的量对你的连接有好处。
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4楼2008-11-28 15:51:36
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